菠蘿蛋白酶對干白葡萄酒蛋白質穩定性的影響

張夢園，董 爍，李 婧，李 輝，張軍翔*

（1.寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學 葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021；3.寧夏出入境檢驗檢疫局綜合技術中心，寧夏 銀川 750021）

菠蘿蛋白酶對干白葡萄酒蛋白質穩定性的影響

張夢園1，董 爍2，李 婧3，李 輝1，張軍翔2*

（1.寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學 葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021；3.寧夏出入境檢驗檢疫局綜合技術中心，寧夏 銀川 750021）

研究菠蘿蛋白酶對干白葡萄酒蛋白質穩定性的影響，以新鮮干白葡萄酒為試驗材料，添加菠蘿蛋白酶，通過測定葡萄酒的濁度、蛋白質穩定性、蛋白質含量，確定其最適添加量、作用溫度和作用時間。結果表明，菠蘿蛋白酶對兩款酒樣澄清的最佳添加量分別為2.0 mg/L、2.5 mg/L，溫度均為22℃，作用時間為24 h。菠蘿蛋白酶可澄清干白葡萄酒，明顯提高其蛋白質穩定性。

蛋白質穩定性；菠蘿蛋白酶；澄清

干白葡萄酒的蛋白質穩定性對酒的品質具有重要作用。幼年白葡萄酒裝瓶后，在一定貯藏條件下，瓶中的蛋白質粒子或其反應物逐漸聚集，可能使葡萄酒變得渾濁不清，產生沉淀，嚴重影響葡萄酒的感官質量。因此，研究葡萄酒的蛋白質穩定性，避免白葡萄酒在貯藏過程中出現蛋白渾濁現象，具有重要的實際意義。葡萄酒的渾濁程度由濁度反映，濁度越大渾濁程度越高。葡萄酒的蛋白質穩定性由熱檢驗前后葡萄酒的濁度差表示，與形成蛋白質渾濁的可能性成正比。一般認為，濁度差不超過2 NTU（濁度單位）即可判定該葡萄酒蛋白質穩定[1]。

近些年使用蛋白質水解酶代替皂土處理葡萄酒防止蛋白質破敗，已經引起研究人員和釀酒師們的重視。蛋白質是由氨基酸通過肽鍵連接起來的一種多肽大分子，可以找出一種或幾種非專一酶切位點的酶對葡萄酒中的蛋白質進行酶切，將酒中的蛋白質分子切成小肽片段或氨基酸，這樣在防止酒中蛋白質不穩定性的同時，既不顯著影響葡萄酒的感官品質，又能增加酒中多肽和氨基酸的含量，提高酒的營養價值[2]。

從植物中提取的蛋白酶類由于具有一定的澄清效果，被逐漸應用于飲料、果酒、啤酒的澄清。郭玉蓉[3]研究表明，木瓜蛋白酶對梅鹿輒干紅葡萄酒的澄清效果好，用量少、脫色輕；陳彥雄等[4]研究認為木瓜蛋白酶是較理想的赤霞珠葡萄酒澄清劑。張傳軍[5]研究發現，0.6%的木瓜蛋白酶在45℃反應38h后，可有效減少白葡萄酒中非穩定蛋白含量。柴麗娟等[6]向紅葡萄酒中添加生姜蛋白酶，研究結果顯示其對紅葡萄酒的澄清效果顯著。菠蘿蛋白酶是存在于菠蘿莖和果實中的一類蛋白水解酶，屬于半胱氨酸蛋白酶，已經應用于白葡萄酒中預防酒體渾濁[7]。菠蘿蛋白酶水解蛋白質的活性較木瓜蛋白酶高10倍以上，具有很強的分解蛋白質能力，并且具有酯鍵和酰胺鍵特性，已被廣泛應用于化工、醫藥和食品行業[8]。徐鳳彩等[9]用菠蘿蛋白酶處理啤酒后，處理組比對照組啤酒的渾濁度下降了1.51～5.3倍，蛋白質含量下降了73%，而啤酒的口感、酒精含量、色度、總酸等指標無明顯變化。BENUCCI I等[10]最新研究顯示固定化菠蘿蛋白酶在減少沉淀形成和總蛋白質含量的影響上，比固定化木瓜蛋白酶更顯著，同時對葡萄酒的酚類物質，礦物成分及感官品質影響不明顯。目前，國內關于菠蘿蛋白酶澄清干白葡萄酒及其對干白葡萄酒中蛋白質穩定性影響的研究還鮮見報道。

為了更好地解決白葡萄酒貯藏過程中出現蛋白沉淀的現象，又同時保留酒的香氣、風味，本試驗利用菠蘿蛋白酶水解賀蘭山東麓霞多麗、貴人香干白葡萄酒中的不穩定蛋白，通過測定干白葡萄酒的濁度、蛋白質穩定性、葡萄酒中的蛋白質總量，研究菠蘿蛋白酶的最佳用量和作用溫度、作用時間，觀察菠蘿蛋白酶對干白葡萄酒的澄清效果，及其對干白葡萄酒中蛋白質穩定性的影響。以期為干白葡萄酒的澄清提供新的方法，為菠蘿蛋白酶應用于提高干白葡萄酒的蛋白質穩定性的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

2016年10月未澄清的霞多麗干白葡萄酒（A）：寧夏類人首葡萄酒業有限公司；2016年10月未澄清的貴人香干白葡萄酒（B）：寧夏西夏王葡萄酒業有限公司。

1.1.2 試劑

菠蘿蛋白酶（酶活600 U/mg）：成都艾科達化學試劑有限公司；考馬斯亮藍R-250、磷酸、乙醇（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；牛血清白蛋白溶液標準物質（2.0 mg/mL）：美國Pierce公司。

1.2 儀器與設備

2100Q濁度計：美國哈希公司；TU-1901紫外可分光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DHG-9070A恒溫干燥箱：上海右一儀器有限公司；FA1004萬分之一天平：上海上天精密儀器有限公司；PHS-3C pH計：上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菠蘿蛋白酶最適添加量、最適作用溫度、作用時間的

確定

取40mL干白葡萄酒樣于棕色玻璃密封瓶中，分別用菠蘿蛋白酶在一定溫度條件下作用一定時間后用0.45 μm濾膜進行過濾[11]。每個處理重復三次。分別考察不同菠蘿蛋白酶添加量（0、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L、3.0mg/L、3.5mg/L）、不同作用溫度（18℃、20℃、22℃、24℃、26℃）、不同作用時間（12 h、24 h、48 h、72 h、96h）對干白葡萄酒濁度、蛋白質總量和蛋白質穩定性的影響。

1.3.2 測定方法

標準曲線繪制：取6支試管分別配制0、10mg/L、20mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L的牛血清白蛋白溶液各2 mL，從各試管中分別取1 mL溶液于具塞試管中，加入5 mL考馬斯亮藍R-250溶液混合均勻，待反應20 min后，在波長595 nm處測其吸光度值。以吸光度值（x）為橫坐標，牛血清白蛋白含量（y）為縱坐標，繪制牛血清白蛋白標準曲線，得到牛血清白蛋白標準曲線回歸方程為：y=246.37x-3.645 2，相關系數R2=0.994 2。

樣品中蛋白質總量的測定：采用考馬斯亮藍R-250染色法[12]，取1 mL過濾后的酒樣，加入5 mL考馬斯亮藍R-250溶液，以用1 mL蒸餾水作空白，待反應20 min后，在波長595 nm處測其吸光度值，根據牛血清白蛋白標準曲線計算酒樣中蛋白質總量。

濁度：采用濁度儀測定[13]，以干白葡萄酒的濁度值表示酒樣的澄清度，濁度值越小澄清度越好。

蛋白質穩定性：將菠蘿蛋白酶水解且過濾的酒液用濁度儀測定其濁度值，以NTU（散射濁度單位）表示，記為α。將酒液放入80℃恒溫水浴鍋中加熱6 h后，于4℃保持16 h，最后冷卻至室溫，再用濁度儀測定其測濁度，記為β[14]。計算加熱處理前后的濁度差（濁度差=β-α），濁度差不超過2NTU則可判定葡萄酒蛋白質穩定，反之不穩定[15]。

2 結果與分析

2.1 菠蘿蛋白酶添加量的確定

2.1.1 菠蘿蛋白酶添加量對干白葡萄酒濁度及蛋白質穩定

性的影響

考察菠蘿蛋白酶添加量對干白葡萄酒濁度和蛋白質穩定性的影響，結果見圖1。

圖1 菠蘿蛋白酶添加量對葡萄酒濁度（a）和蛋白質穩定性（b）的影響Fig.1 Effect of bromelain addition on wine turbidity(a)and protein stability(b)

由圖1可知，隨著菠蘿蛋白酶添加量的增加，葡萄酒的濁度和澄清度均呈先降低后增加的趨勢，其中A款葡萄酒在添加2.0 mg/L的菠蘿蛋白酶時濁度最小（1.73 NTU），澄清度良好，熱處理濁度差最小（1.43 NTU），表明蛋白質穩定性良好；隨后菠蘿蛋白酶添加量增加，葡萄酒的濁度上升，濁度差變大；B款葡萄酒在菠蘿蛋白酶添加量2.5 mg/L時濁度達到最小，蛋白質最穩定。添加菠蘿蛋白酶對葡萄酒中不穩定蛋白質進行水解，可提高葡萄酒的澄清度和蛋白質穩定性，但當葡萄酒中的菠蘿蛋白酶超過最適添加量之后，由于其本身屬于一種蛋白質，過多的菠蘿蛋白酶反而不利于葡萄酒的蛋白質穩定性。因此，A款和B款葡萄酒的菠蘿蛋白酶最適添加量分別為2.0 mg/L和2.5 mg/L。

2.1.2 菠蘿蛋白酶添加量對干白葡萄酒中蛋白質總量的影響

考察菠蘿蛋白酶添加量對干白葡萄酒中蛋白質總量的影響，結果見圖2。

圖2 菠蘿蛋白酶添加量對干白葡萄酒中蛋白質總量的影響Fig.2 Effect of bromelain addition on total protein content in dry white wine

由圖2可知，隨著菠蘿蛋白酶用量的增加，兩款葡萄酒中的蛋白質總量均呈先降低后增加的趨勢，其中A款葡萄酒添加2.0 mg/L菠蘿蛋白酶時，蛋白質總量下降到最小（15.04 mg/L）；B款葡萄酒添加2.5 mg/L菠蘿蛋白酶時，蛋白質總量最小（14.30 mg/L）。繼續增加菠蘿蛋白酶添加量，兩款葡萄酒的蛋白質總量均開始上升，這與喬園園[17]的研究結果相似，高酶濃度處理過的酒樣會受蛋白酶的影響，蛋白質含量增多，不利于葡萄酒優良品質的形成。結果表明，A款和B款葡萄酒的菠蘿蛋白酶最適添加量分別為2.0mg/L和2.5 mg/L。

2.2 菠蘿蛋白酶作用溫度的確定

考察菠蘿蛋白酶作用溫度對干白葡萄酒蛋白質穩定性的影響，結果見圖3。

由圖3可知，隨著作用溫度的升高，兩款酒樣的濁度差均先下降后趨于平緩。經菠蘿蛋白酶作用后兩款葡萄酒熱處理后濁度差均＜2 NTU，表明蛋白質穩定性較好；當作用溫度為22℃時，A、B兩款葡萄酒的濁度差最小，分別為1.54 NTU和1.18 NTU，此時葡萄酒的蛋白質穩定性最好。溫度對植物蛋白酶的活性影響很大，BENUCCI I等[16]研究結果表明，菠蘿蛋白酶在10～60℃均有活性，但因生產中溫度過高會影響葡萄酒的香氣和品質，也會增加蛋白質渾濁產生的風險。由圖3可知，選擇22℃為菠蘿蛋白酶的最適作用溫度。

圖3 菠蘿蛋白酶的作用溫度對蛋白質穩定性的影響Fig.3 Effect of bromelain action temperature on protein stability

考察菠蘿蛋白酶作用溫度對干白葡萄酒蛋白質總量的影響，結果見圖4。

圖4 菠蘿蛋白酶作用溫度對葡萄酒中蛋白質總量的影響Fig.4 Effect of bromelain action temperature on total protein content

由圖4可知，隨著作用溫度在18～26℃范圍內增加，A、B兩款酒的蛋白質總量先降低后趨于平緩。當作用溫度為22℃時，蛋白質總量最低，菠蘿蛋白酶的作用效果最好，水解酒樣中的蛋白質最多，生產中溫度過高會增加葡萄酒產生渾濁的風險，也會損耗酒的香氣，所以參考實際試驗，選擇22℃為菠蘿蛋白酶的最適作用溫度。

2.3 菠蘿蛋白酶作用時間的確定

考察菠蘿蛋白酶作用時間對干白葡萄酒蛋白質穩定性的影響，結果見圖5。

由圖5可知，隨著菠蘿蛋白酶作用時間的延長，葡萄酒的濁度差先下降后趨于平緩。當作用時間為12 h時，A、B兩款酒的濁度差均＞2 NTU，蛋白質不穩定，當作用時間≥24 h，葡萄酒的濁度差均＜2 NTU，且隨著時間的延長變化不明顯，表明蛋白質穩定性良好，因此24 h可作為菠蘿蛋白酶的最佳作用時間。

圖5 菠蘿蛋白酶作用時間對蛋白質穩定性的影響Fig.5 Effect of bromelain action time on protein stability

考察菠蘿蛋白酶作用時間對干白葡萄酒蛋白質總量的影響，結果見圖6。

圖6 菠蘿蛋白酶的作用時間對葡萄酒蛋白質總量的影響Fig.6 Effect of bromelain action time on total protein content

由圖6可知，隨著菠蘿蛋白酶作用時間的延長，葡萄酒的蛋白質總量先下降后趨于平緩。A、B兩款葡萄酒經菠蘿蛋白酶作用12 h，酒樣中的蛋白質總量最高，為19.02 mg/L；當作用時間為24h，酒樣中的蛋白質總量減小，為12.12mg/L；繼續延長作用時間，A、B兩款葡萄酒中蛋白質總量沒有明顯變化，趨于穩定。在酒樣相同（即底物濃度一定）且菠蘿蛋白酶添加量一定，作用溫度相同的情況下，蛋白酶保持活性將酒中的不穩定蛋白水解為小肽片段、氨基酸；水解酶作用結束，失去活性，酒樣中蛋白質總量減小且隨時間變化不再明顯變化。從經濟效益及操作效率方面考慮，菠蘿蛋白酶對白葡萄酒中的蛋白質水解的最佳作用時間為24 h。

3 結論

本試驗采用菠蘿蛋白酶澄清干白葡萄酒，研究了其對白葡萄酒濁度及蛋白質總量的影響。結果表明，A、B兩款葡萄酒的菠蘿蛋白酶最適添加量分別為2.0 mg/L和2.5 mg/L，22℃作用24 h時，菠蘿蛋白酶對干白葡萄酒的澄清效果較好，且蛋白質穩定性良好。目前，葡萄酒廠為提高干白葡萄酒的澄清度和蛋白質穩定性，主要選擇皂土作為澄清劑，而皂土所存在的諸多弊端使尋找新的可替代澄清材料成為白葡萄酒生產的迫切需求，經試驗發現菠蘿蛋白酶可澄清干白葡萄酒，提高其蛋白質穩定性，有望在今后應用于廣泛的生產中，具有一定實際意義。

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Effect of bromelain on protein stability of dry white wine

ZHANG Mengyuan1,DONG Shuo2,LI Jing3,LI Hui1,ZHANG Junxiang2*
(1.School of Agriculture,Ningxia University,Yinchuan 750021,China;2.Wine School,Ningxia University,Yinchuan 750021,China;3.Technology Center of Ningxia Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Yinchuan 750021,China)

The effect of bromelain on protein stability of dry white wine was researched.Using the fresh dry white wine as experimental material,with addition of bromelain,the optimum bromelain addition,action temperature and time were determined by the determination of wine turbidity,protein stability and protein content.The results showed that the optimum bromelain addition to clarify two wine samples were 2.0 mg/L and 2.5 mg/L,respectively.The action temperature and time were 22℃and 24 h,respectively.The bromelain could clarify dry white wine and improve protein stability significantly.

protein stability;bromelain;clarification

TS262.6

0254-5071（2017）10-0052-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.012

2017-05-23

寧夏重點研發計劃重大項目（2016BZ06）

張夢園（1992-），女，碩士研究生，研究方向為葡萄酒的穩定性。

*通訊作者：張軍翔（1971-），男，教授，博士，研究方向為葡萄與葡萄酒釀造。