多重PCR法同時檢測黃酒酒曲中多種生物胺產生菌

朱曉娟，趙 磊，徐瑞濤，王道安，陳 爍，金佳玉，張 健*

（天津科技大學 生物工程學院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

多重PCR法同時檢測黃酒酒曲中多種生物胺產生菌

朱曉娟，趙 磊，徐瑞濤，王道安，陳 爍，金佳玉，張 健*

（天津科技大學 生物工程學院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

該研究建立了檢測多種生物胺產生菌的多重聚合酶鏈反應（PCR）方法，首先檢測了已報道的針對酪胺、腐胺產生菌和革蘭氏陰性組胺產生菌的多對引物的特異性，針對革蘭氏陰性菌的組氨酸脫羧酶基因的引物特異性差，重新設計了該引物，在此基礎上，建立了可同時檢測酪胺、腐胺和組胺產生菌的多重PCR方法，并優(yōu)化了多重PCR反應條件為退火溫度50℃，Mg2+濃度1.0 mmol/L，引物濃度配比為Tdc-F/R 0.2 μmol/L，Hdc1/2 0.4 μmol/L和Odc3/4 0.4 μmol/L。該方法特異性強，對酪胺、腐胺和組胺產生菌的靈敏度分別為1.2 ng/μL、1.5 ng/μL和1.5 ng/μL，可用于黃酒酒曲中生物胺產生菌的快速檢測。

多重聚合酶鏈反應；檢測；黃酒酒曲；生物胺產生菌

生物胺是一類低分子質量含氮的堿性有機化合物，其產生通常需要3個條件：有分泌氨基酸脫羧酶的微生物；前體物質（氨基酸）的存在；具有適宜這些微生物生長和分泌氨基酸脫羧酶的環(huán)境條件。生物胺普遍存在于多種食品中，尤其是黃酒、葡萄酒、啤酒、奶酪和發(fā)酵香腸等發(fā)酵食品中[1]。適量的生物胺在生物體內具有重要的生理作用，但是，當人體吸收過量的生物胺時，將產生一系列應激反應，可能引起頭痛、呼吸紊亂、心悸等不良癥狀，嚴重情況下，可以引起大腦出血，甚至死亡[2]。在眾多的生物胺中，組胺對人體的毒害作用最大，其次是酪胺[3]，腐胺、尸胺、精胺和亞精胺沒有明確的危害健康的作用[4]，但是它們與氮結合會產生致癌物質亞硝酸鹽，它們的存在還會加強酪胺和組胺的毒性[5]。因為個體差異的影響，以及食品中其他胺類物質的干擾，使得生物胺的毒理學評估非常困難，現有的限量標準主要是針對組胺和酪胺。美國食品及藥物管理局（food and drug administration，FDA）規(guī)定水產品中組胺的限量標準為50 mg/kg，酪胺的限量標準為100 mg/kg；歐盟規(guī)定在魚類食品中，組胺的限量標準為100 mg/kg[6]。在酒類飲料中尚無生物胺的限量標準，只有可能的引起中毒的含量，如組胺2～10 mg/L，酪胺10～80 mg/L，苯丙氨酸3 mg/L[7]。雖然各個國家針對生物胺的風險評估有一定差異，但共識是應努力減少食品中生物胺含量，從而降低食品攝入風險[8]。黃酒中的生物胺含量在39.30～241 mg/L之間，其中組胺、酪胺和腐胺所占的比例最大[9]。生物胺一旦形成，很難去除[10]，因此在生物胺產生之前，對其形成風險進行預警至關重要，而對生物胺產生菌的檢測則是風險預警的核心問題。

檢測生物胺產生菌的方法有三種：微生物學方法、化學方法和分子生物學方法。微生物學方法的基本原理是根據產生生物胺菌株的生理特征及其生長過程中的生化變化，采用特異性選擇培養(yǎng)基來進行篩選、鑒別，此方法誤差大，只適合于初篩[11]；化學方法即利用各種測定生物胺的化學手段測定細菌培養(yǎng)液中生物胺的含量，從而對微生物菌株做出判定。目前應用最為普遍的化學方法是高效液相色譜（highperformance liquidchromatography，HPLC）法。化學方法不僅可以定性判定產生物胺的微生物菌株，而且還可以定量評價其生物胺的產生能力，從而對其安全性做出評價。但該類方法費時費力，且只有生成生物胺才能檢測，達不到預警的效果[12]；分子生物學方法是根據已鑒定的氨基酸脫羧酶的氨基酸序列保守區(qū)設計引物，通過聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術進行擴增，根據電泳分析和序列比對來判定其是否具有氨基酸脫羧酶，從而確定該菌株是否具有產生物胺的能力，此類方法操作簡便、特異性強、靈敏度高，且可在生物胺未產生前檢測到生物胺產生菌，可用于菌株風險評估和發(fā)酵預警[13]。引物、反應體系和條件是PCR檢測方法的關鍵。當前PCR分子檢測技術已成功應用于細菌的氨基酸脫羧酶基因檢測，如酪胺產生菌，腐胺產生菌和組胺產生菌[14]，然而對某些革蘭氏陰性的組胺產生菌不能得到有效擴增[15]，因此進行全新的引物設計精確檢測革蘭氏陰性組胺產生菌顯得尤為重要。另外，多重PCR作為一種在常規(guī)PCR基礎上改進發(fā)展起來的新型PCR擴增技術，可同時檢測多種樣品，具有高效、高產、低成本等優(yōu)點，目前已經得到廣泛應用，并成為樣品快速檢測技術的發(fā)展方向[16]。多重PCR的引物選擇是較為關鍵的步驟，盡量使各引物的退火溫度一致，避免同對引物或多對引物之間形成引物二聚體，避免引物之間的同源性及堿基互補性。除此之外，反應體系的組成，如緩存液的成分、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）的濃度和反應條件都會影響實驗結果[17]。

黃酒中所含生物胺的量遠遠大于其他發(fā)酵酒類，這主要是釀造黃酒原料中富含較多氨基酸，為生物胺的形成提供了豐富的前體物質[8]，同時在釀造過程中添加含有大量微生物的酒曲進行開放式發(fā)酵，引入了大量產生氨基酸脫羧酶的微生物[18]，從而導致了生物胺的大量產生。針對上述問題，本研究設計了針對革蘭氏陰性組胺產生菌的全新的引物，通過優(yōu)化多重PCR的反應條件，建立了可同時檢測酪胺、腐胺和革蘭氏陰性組胺產生菌的多重PCR檢測方法。目的是用于黃酒釀造之初的安全預警，提升相關行業(yè)的安全生產能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

12株生物胺產生菌株，3株不產生物胺的菌株：篩選自黃酒酒曲，為天津科技大學生化過程與技術實驗室保存菌株，其編號、革蘭氏染色結果和產生物胺種類詳見表1。

表1 實驗所用菌株名稱及性質Table 1 Name and nature of experimental strains

1.1.2 主要試劑

100 bp ladder Marker、DL 5kbp Marker、rTaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、10×PCR buffer（Mg2+free）、10×PCR buffer（Mg2+plus）、細菌DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒：大連寶生物有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨17 g/L，大豆蛋白胨3 g/L，葡萄糖2.5 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，調節(jié)pH為7.3～7.5，121℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

5334 PCR擴增儀、微量移液器、5418R離心機：德國Eppendorf公司；DU640核酸蛋白分析儀：美國Backman公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一生物科技公司；ChampGel5000凝膠成像儀：北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；UV-1800PC分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模板DNA的制備及質量測定

將-80℃凍存的菌株接于TSB液體培養(yǎng)基上，37℃活化12h，于相應固體平板上進行劃線分離，37℃培養(yǎng)24h后，挑取單菌落于TSB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)10 h左右。分別測量菌體的OD600nm值（革蘭氏陽性細菌的OD600nm＜1.0，革蘭氏陰性細菌的OD600nm＞1.0時，符合基因組試劑盒的要求），按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明制備模板DNA。并利用核酸蛋白分析儀測量DNA的濃度。將制備好的模板DNA進行分裝，-20℃凍存。

1.3.2 引物設計

組氨酸脫羧酶可使組氨酸脫羧形成組胺，酪氨酸脫羧酶可使酪氨酸脫羧形成酪胺，而鳥氨酸脫羧酶催化鳥氨酸脫羧形成腐胺。組氨酸脫羧酶包括兩種類型：源于革蘭氏陽性菌的丙酮酰依賴型和源于革蘭氏陰性菌的磷酸吡哆醛依賴型。酪氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶通常不按革蘭氏染色分類[19]。本研究選取已報道的針對磷酸吡哆醛依賴型組氨酸脫羧酶基因的引物Hdc-2F/Hdc-2R、KPF2/KPR4、Hdc-f/Hdc-r、106/107、HIS2-F/HIS2-R，針對酪氨酸脫羧酶基因的引物（Tdc-F/R）和針對鳥氨酸脫羧酶的引物（Odc3/4）來驗證引物的特異性。根據美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）最新收錄的源于菌株Enterobactersp.的組氨酸脫羧酶序列及與之高度相似（99%）并且同屬磷酸吡哆醛依賴型天冬氨酸轉氨酶超家族的源于Enterobacter cloacae，Enterobacter asburiae的2,4-二氨基丁酸脫羧酶序列進行比對，利用PrimerPremier 5.0軟件進行引物設計，合成新的引物組氨酸脫羧酶的引物Hdc1/Hdc2（GGYTNAARCARCCNGARATG/GCRTCNACRTGNACCCADAT）。所有引物均由北京華大基因有限公司合成，序列詳細信息見表2。

表2 多重PCR引物設計Table 2 Design for premiers of multiplex PCR

1.3.3 單一PCR擴增條件

采用已報道的引物，擴增時的反應體系和條件均參見表2。采用Hdc1/Hdc2引物PCR擴增時的反應體系（25 μL）：10×Buffer：2.5 μL，rTaq聚合酶0.25 μL（5 U/μL），dNTPs：2.0 μL（各2.5 mmol/L），DNA模板1.0 μL（10 ng/μL），引物1.0μL（初始濃度10μmol/L），其余用雙蒸水補足。反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸2min，30個循環(huán)，72℃延伸10min。反應結束后，取4μL PCR產物，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。取50 μL擴增體系的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后進行切膠回收，采用大連寶生物的純化回收試劑盒回收片段，交給北京華大基因有限公司進行測序。

1.3.4 多重PCR條件優(yōu)化

按照L16（45）正交設計，優(yōu)化多重PCR的退火溫度、Mg2+濃度以及各引物的濃度，其他反應條件和反應體系同1.3.3。因為沒有菌株同時產酪胺、腐胺和組胺，所以分別選取菌株Mc4（產組胺和腐胺）和菌株La8（產酪胺）為目標菌，進行正交試驗。綜合考慮菌株Mc4擴增時組氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶基因片段擴增后的條帶的明亮程度，以及菌株La8擴增時酪氨酸脫羧酶基因片段擴增后的條帶的明亮程度選擇最優(yōu)的因素水平組合，確定多重PCR的最佳反應體系和條件。

1.3.5 多重PCR特異性實驗

選取菌株Mc4、La8的DNA進行混合，根據其DNA含量1.0∶0.5（10 ng∶5 ng）組合，陰性菌株Ma7、Qa1及Qa2做模板。按照1.3.4優(yōu)化的條件進行擴增，檢測3對引物Hdc1/Hdc2、Tdc-F/Tdc-R、Odc3/Odc4的特異性。

1.3.6 多重PCR的靈敏度測試

分別將菌株Mc4和La8的DNA按照測定濃度進行10倍比梯度稀釋，使兩株菌株的DNA質量濃度分別為150ng/μL、15 ng/μL、1.5 ng/μL、0.15 ng/μL和120 ng/μL、12 ng/μL、1.2ng/μL、0.12ng/μL。分別按照1.3.4優(yōu)化的條件進行擴增，分析多重PCR對檢測酪胺、腐胺和革蘭氏陰性組胺產生菌的靈敏度。

1.3.7 多重PCR方法對黃酒酒曲篩選菌株的檢測應用

按照1.3.4優(yōu)化好的多重PCR方法對黃酒酒曲中篩選出來的菌株進行多重PCR擴增，驗證該方法對黃酒酒曲中生物胺產生菌檢測的有效性。

2 結果與分析

2.1 單重PCR檢測結果

按照文獻[20-26]中報道的7對引物，將12株產生物胺陽性菌株和3株不產生物胺的陰性菌株（見表2）進行擴增，其中2株陽性菌株的擴增結果如圖1所示。由圖1可知，腐胺產生菌擴增片段為1056bp，酪胺產生菌擴增片段為825bp，且符合預期結果大小；而組胺產生菌均未得到有效擴增；對3株陰性菌株，所有引物均無法擴增出條帶。從NCBI數據庫搜索可知，這些針對組氨酸脫羧酶的引物，靶標均為含有378個氨基酸的組氨酸脫羧酶的基因序列。2014年NCBI近新收錄的腸桿菌屬的組氨酸脫羧酶含有488個氨基酸，該酶與含有378個氨基酸的組氨酸脫羧酶的序列差別很大，相似度僅為15%，而與2,4-二氨基丁酸脫羧酶序列高度相似，相似度為99%。目前雖然沒有2,4-二氨基丁酸脫羧酶可以催化組氨酸脫羧合成組胺的報道，但已有其能轉化酪氨酸生成酪胺的報道[27]，考慮到2,4-二氨基丁酸脫羧酶與組氨酸脫羧酶同屬磷酸吡哆醛依賴型天冬氨酸轉氨酶超家族，且該酶和腸桿菌屬的含有488個氨基酸的組氨酸脫羧酶的高度相似性，推測該酶很可能具有與組氨酸脫羧酶同樣的功能。因此，本研究比較了腸桿菌屬的組氨酸脫羧酶和本研究所用菌株中的2,4-二氨基丁酸脫羧酶序列，設計了全新的引物Hdc1/Hdc2。按照1.3.3的擴增條件，對所有9株產組胺的菌株，采用該引物均可擴增出大小為735 bp的條帶，而對3株陰性對照菌株均沒有擴增出條帶。這說明新設計的組胺酸脫羧酶引物可以有效檢測組胺產生菌。

圖1 單重PCR擴增產物凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of monoplex PCR amplification products

2.2 多重PCR條件優(yōu)化

由于單重PCR在進行操作時需要逐一加入單對引物和模板，為使操作更加簡便，本實驗建立了多重PCR的方法。單一PCR分別檢測酪胺，腐胺和革蘭氏陰性組胺產生菌時，所用的引物具有不同Tm值，則進行PCR時退火溫度會有明顯不同，各引物與模板結合的偏好性不同，則各引物的終濃度會不同。因此要建立同時檢測酪胺，腐胺和革蘭氏陰性組胺產生菌的多重PCR方法，必需要對反應體系和退火溫度進行優(yōu)化。本研究采用L16（45）正交設計對3對引物的濃度，退火溫度和Mg2+濃度進行優(yōu)化，結果見表3。由表3可知，6號試驗效果較好，即退火溫度為50℃，Mg2+濃度為1.0 mmol/L，引物濃度配比為：Tdc-F/R 0.2 μmol/L，Hdc1/2 0.4 μmol/L和Odc3/4 0.4 μmol/L。在最佳的結果下，多重PCR的凝膠電泳圖見圖2所示，三對引物均能得到較亮的擴增條帶，說明該組正交試驗結果較好。

表3 多重PCR條件優(yōu)化正交試驗設計Table 3 Design of orthogonal experiments for PCR conditions optimization

圖2 多重PCR擴增產物凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of multiplex PCR amplification products

2.3 多重PCR特異性檢驗

為了進一步對多重PCR的引物進行特異性檢驗，驗證不同引物和模板之間是否會形成錯配，將菌株Mc4和La8的DNA模板按照DNA含量1.0∶0.5（10 ng∶5 ng）比例進行預混作為模板，擴增條件按照2.2優(yōu)化的結果。多重PCR特異性檢驗結果見圖3。由圖3可知，多重PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，結果表明這三種引物能夠很好的擴增生物胺產生菌的氨基酸脫羧酶序列，特異性條帶較亮，任意一株陰性對照組都沒有出現擴增，沒有出現非特異性條帶，可得到這三對引物特異性良好。表明建立的多重PCR方法對檢測腐胺和酪胺產生菌以及革蘭氏陰性組胺產生菌，具有較好的特異性。

圖3 多重PCR特異性擴增產物凝膠電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis of multiplex PCR specificity amplification products

2.4 多重PCR靈敏度檢驗

菌株Mc4和La8的DNA質量濃度分別是150.200ng/μL、120.850 ng/μL，將其進行十倍梯度稀釋，以該DNA稀釋液做模板進行PCR反應，從而確定DNA最低檢測限，結果見圖4。由圖4可知，當模板質量濃度為1.5ng/μL為檢測到組胺條帶最低濃度，1.5 ng/μL為檢測到腐胺條帶的最低濃度，1.2 ng/μL為檢測酪胺條帶的最低濃度。瓊脂糖凝膠電泳表明三種引物，Hdc1/2、Odc3/4、Tdc-F/R引物所對應的各自DNA模板檢出限分別為1.5 ng/μL、1.5 ng/μL及1.2 ng/μL。

圖4 多重PCR靈敏度擴增產物凝膠電泳圖Fig.4 Gel electrophoresis of multiplex PCR sensitivity amplification products

2.5 多重PCR方法對黃酒酒曲生物胺產生菌株的檢測應用

通過篩選出的兩株菌建立了酪胺，腐胺和革蘭氏陰性組胺產生菌的多重PCR方法，為了進一步驗證及應用該方法，按照多重PCR的優(yōu)化條件，對酒曲中篩選出的在不同培養(yǎng)基富集的全部菌株進行應用，結果見圖5。由圖5可知，三對引物都能夠在對應的位置得到相應的PCR擴增產物，結果表明，建立的多重PCR方法在檢測黃酒酒曲中生物胺產生菌時，與這12株菌的HPLC的結果具有一致性。其中菌株Mc4在735 bp處和1 056 bp處有條帶，說明該菌株能夠產生組胺和腐胺，由圖6可知，菌株Mc4發(fā)酵液（培養(yǎng)4 d）高效液相色譜檢測結果中出現組胺和腐胺色譜峰，表明該多重PCR的方法可以用于酒曲中生物胺產生菌的快速檢測。

圖5 多重PCR檢測黃酒酒曲生物胺產生菌擴增產物凝膠電泳圖Fig.5 Gel electrophoresis of multiplex PCR amplification products of biogenic amines-producing bacteria in Chinese rice wineJiuqu

圖6 生物胺標準品及菌株Mc4產生物胺的高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of biological amine standard and biogenic amines-produced by strain Mc4

3 結論

本研究建立了一種可同時檢測三種生物胺產生菌的多重PCR的方法。在進行PCR的過程中，選取了文獻中報道的兩對特異性引物[20-22]。另外根據某些生物胺產生菌的種屬，進行了全新的引物設計，得到了一對能夠擴增革蘭氏陰性組胺產生菌的引物。對多重PCR的過程進行了優(yōu)化，最后的優(yōu)化結果為退火溫度50℃，Mg2+濃度1.0 mmol/L，引物Tdc-F/R濃度0.2 μmol/L，Odc3/4濃度0.4 μmol/L，Hdc1/2濃度0.4 μmol/L，該方法特異性強，對酪胺、腐胺和組胺產生菌的靈敏度分別為1.2ng/μL、1.5ng/μL和1.5 ng/μL，該方法可有效應用于黃酒酒曲中生物胺產生菌的檢測，對黃酒的安全生產有重要意義。

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Multiplex polymerase chain reaction for simultaneous detection of biogenic amines-producing bacteria in Chinese rice wineJiuqu

ZHU Xiaojuan,ZHAO Lei,XU Ruitao,WANG Daoan,CHEN Shuo,JIN Jiayu,ZHANG Jian*
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science＆Technology,Tianjin 300457,China)

A multiplex polymerase chain reaction (mPCR)method for the detection of biogenic amines-producing bacteria established in this research.Firstly,the specificity of some reported primers against tyramine,putrescine and gram-negative histamine-producing bacteria was detected,and the poor primer-specificity against gram-negative histamine-producing bacteria was observed.To solve this problem,the primers for gram-negative histamine producing bacteria were redesigned.A mPCR method for simultaneous detection of tyramine,putrescine and histamine-producing bacteria was established.After that,the annealing temperature was 50℃,the concentration of Mg2+was 1.0 mmol/L and the concentration ratio of the Tdc-F/R,Hdc1/2,Odc3/4 primers were 0.2 μmol/L,0.4 μmol/L,and 0.4 μmol/L,respectively.This method was specific for amplification of the biogenic amine-producing bacteria.The detect sensitivity of tyramine,putrescine and histamine were 1.2 ng/μl,1.5 ng/μl,and 1.5 ng/μl,respectively.The method can be applied in the rapid detection biogenic amines-producing bacteria in Chinese rice wineJiuqu.

multiplex polymerase chain reaction;detection;Chinese rice wineJiuqu;biogenic amines-producing bacteria

TS207.3

0254-5071（2017）10-0036-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.009

2017-07-16

國家自然科學基金資助項目（31471725）；天津科技大學大學生實驗室創(chuàng)新基金（1604A103）

朱曉娟（1992-），女，碩士研究生，研究方向為輕工技術與工程。

*通訊作者：張 健（1978-），男，副研究員，博士，研究方向為發(fā)酵食品安全。