高耐性釀酒酵母的篩選及其耐受性研究

付肖蒙，王鵬飛，郝愛麗，洪坤強，肖冬光*

（天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

高耐性釀酒酵母的篩選及其耐受性研究

付肖蒙，王鵬飛，郝愛麗，洪坤強，肖冬光*

（天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

優良的耐逆性菌株的添加能有效提高醬油生產效率和產品品質風味，該研究篩選出兩株耐高溫、耐高滲和耐高酸的酵母菌株用于醬油發酵。通過對酵母菌株高溫熱激之后稀釋點板，對比各稀釋度的菌落數量和形態，以及通過在高滲板和高酸板上各個菌的生長情況和在抗性培養基中菌的生長曲線測定來對比各菌株的耐受性。稀釋點板實驗以及生長曲線結果都顯示，釀酒酵母L-19和L-38在55℃熱激條件下以及在分別含有6%NaCl、0.6%乙酸和5%乳酸固體平板上菌落形態和大小都優于醬油酵母，而且在含有高鹽和高酸的液體培養基中生長速率均高于醬油酵母。因此，成功篩選出兩株具有高耐性的釀酒酵母。

釀酒酵母；高耐性；醬油發酵

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一類單細胞真核微生物，由于其生長旺盛、生物量大和具有較高的生物安全性等優點，廣泛應用于食品、醫藥、能源等領域。工業應用中對酵母的耐受性有很高的要求，酵母在食品工業中也扮演著重要的角色，在醬油發酵過程起著重要的作用。人們期望得到耐高滲透壓、耐高溫、耐高糖、耐高酸等高耐受性的菌株，但是在發酵過程中發酵活動的進行導致酵母的胞外環境不斷的改變導致酵母受到各種環境因素的影響，脅迫環境如高溫、高滲透壓、營養饑餓、高酸、高濃度酒精毒性等不可避免[1]。故而提高酵母菌種的耐受性，可以提高菌種的發酵性能，降低發酵過程中能量消耗，從而提高生產效益和經濟效益。在微生物發酵過程中高濃度的代謝產物以及原料中的毒性底物都會對發酵效率有所影響，高滲透壓不僅會抑制酵母細胞的生長，還對細胞的代謝帶來嚴重影響，使得產物轉化率降低以及發酵時間延長[2-3]。乙酸是纖維素原料水解產生的主要毒副產物之一，其對酵母細胞的生長和代謝都有較強的抑制作用，還有高濃度乙酸和鹽類等都會對發酵過程產生影響從而影響到發酵過程的經濟效益[4-5]，因此高耐性酵母的篩選是改良發酵過程提高發酵工藝生產效率的重要手段。杜昭勵等[6]通過對絮凝基因FLO1及FLO1c的高表達來提高工業釀酒酵母乙酸耐受性雖然耐受性有所提高但是細胞生長速率和發酵速率均受到明顯的抑制。AUESUKAREE C等[7]通過基因工程方法或自然變異得到的耐熱性菌株來研究耐熱性菌株的耐熱機制。KHATUN M M等[8]通過人造鋅指蛋白來提高釀酒酵母在高溫下的乙醇生產率。酵母細胞的耐受性是受到多種基因控制的復雜遺傳性狀，目前對于有關酵母耐受性機制的研究成果較少，并且基于已知分子機制將少數調控基因改造對于酵母耐受性的改善效果十分有限。醬油是中國傳統的發酵調味品，深受廣大消費者的喜愛隨著生活水平的提高，低鹽固態釀造的醬油已經逐漸不能達到人們對品質的追求，這使得高鹽稀態醬油的釀造工藝的應用越來越為廣泛。同時在醬油發酵中，對酵母的耐受性要求很高，高耐性酵母廣泛應用于食品、釀造、飼料、生物能源等行業，酵母的耐受性對其生產和應用有著決定性影響。要進一步的提高高鹽稀態釀造醬油的風味，得到一株高耐鹽的醬油酵母變的至關重要。因此篩選出高耐鹽的菌種十分重要，提高醬油原料利用率和質量，具有一定的經濟和社會效益[9-10]。本研究通過對本實驗室培育得到的7株釀酒酵母進行稀釋點板實驗以及24 h生長曲線測定[11]，更加直觀的對比各個菌株在各種抗性條件下的生長情況并進行耐受性分析，并與高耐性的醬油酵母進行對比，確定出兩株具有高耐性的釀酒酵母，以期為食品工業醬油發酵菌株的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）L-19、L-25、L-26、L-38、L-90、L-122、L-130：本實驗室培育；釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）AY12、魯氏酵母（Saccharomycesrouxii）、球擬酵母（Torulopsis candida）：本實驗室保存。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨20 g/L。

耐NaCl YEPD培養基：YEPD培養基添加60 g/L NaCl。

耐乙酸YEPD培養基：YEPD培養基添加6 mL/L乙酸。

耐乳酸YEPD培養基：YEPD培養基添加50 g/L乳酸。

上述培養基pH自然，1×105Pa滅菌15～20 min，固體培養基需添加20 g/L瓊脂粉。

1.1.3 試劑

葡萄糖（分析純）：天津市永大化學試劑開發中心；胰蛋白胨（生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司；酵母浸粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京Solarbio科技有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市北方化玻購銷中心；乙酸（分析純）、乳酸（分析純）：天津市奧淇洛譜商貿有限公司。

1.2 儀器與設備

Bioscreen C全自動生長曲線分析儀：芬蘭Oy Growth CurvesAb公司；UVmini-1240島津紫外分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司；IS-RDS3恒溫搖床：上海制成儀器制品有限公司；AB204-S型分析天平：梅特勒-托利多儀器上海公司；HS-1300-V型超凈臺：蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高耐性菌株的篩選

本實驗采用梯度稀釋點板的方法[12]，通過觀察菌在含有不同抑制物的固體平板上的生長情況來表征各個菌株在不同脅迫條件下的耐受性。同時通過生長曲線測定來對比篩選菌株與魯氏酵母和球擬酵母的耐受性。

（1）高溫耐受性菌株的篩選

分別接種原始菌株釀酒酵母（S.cerevisiae）AY12和培育菌株釀酒酵母（S.cerevisiae）L-19、L-25、L-26、L-38、L-90、L-122、L-130于20 mL YEPD液體培養基中180 r/min、30 ℃培養24 h，將細胞轉接入5 mL新鮮液體培養基中使初始OD600nm值為0.15，活化至對數中期。測OD600nm值，用YPED調整細胞OD600nm至1.0，取1 mL上述菌液放入1.5 mL EP（Eppendorf）管中，放入55 ℃水浴鍋中熱激5 min，取100 μL熱激后菌液于900 μL無菌水中稀釋十倍按濃度遞減順序，每個稀釋度取2 μL菌液整齊滴在所需平板上，超凈工作臺晾干后，30℃倒置培養2 d后觀察結果。

（2）耐鹽耐酸菌株的篩選

分別接種原始菌株釀酒酵母（S.cerevisiae）AY12和培育菌株釀酒酵母（S.cerevisiae）L-19、L-25、L-26、L-38、L-90、L-122、L-130于YEPD液體培養基中180 r/min、30℃培養24 h，將細胞轉接入5 mL新鮮液體培養基中使初始OD600nm值為0.15，活化至對數中期。測OD600nm值，用YEPD調整細胞OD600nm至1.0，取1mL上述菌液放入1.5mL EP管中，取100 μL熱激后菌液于900 μL無菌水中稀釋10倍按濃度遞減順序，每個稀釋度取2 μL菌液整齊滴在分別含有6%NaCl、0.6%乙酸和5%乳酸固體平板上，超凈工作臺晾干后，30℃倒置培養2 d后觀察結果。

1.3.2 生長曲線的測定

本實驗采用全自動生長曲線測定儀測定OD600nm吸光度值，操作步驟如下：

分別接種5株待測酵母于含有不同抑制物的YEPD液體培養基中，30℃條件下180 r/min培養12 h。取培養好的菌液40 μL接入裝有360 μL液體YEPD培養基的100孔板的孔中，將100孔板置于適當溫度下培養，以YEPD液體培養基為空白對照，每隔0.5h測定波長600nm處的吸光度值，以時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，繪制菌株生長曲線。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母的高溫、NaCl、乳酸、乙酸耐受性的測定

醬油發酵過程中對菌株的耐受性較高，醬油的釀造在高鹽的環境中進行[13]，不僅要求耐高溫、耐高鹽還要耐酸，釀酒酵母的高溫、NaCl、乳酸、乙酸耐受性的測定結果見圖1。

圖1 各酵母菌株對溫度、NaCl、乳酸、乙酸的耐受性Fig.1 Tolerance of yeast strains to temperature,NaCl,lactic acid and acetic acid

由圖1可知，在添加6%NaCl的培養基上培育出的7株菌生長性能均比原菌的生長性能要好，其中，菌株L-38、L-90、L-122及L-130的生長狀況最好；經過55℃熱激5 min之后，生長狀態明顯優于原菌的有菌株L-19、L-38和L-122，其中菌株L-19和L-122的生長狀態最好，可以看出熱激對菌株L-19和L-122的抑制作用最弱；在5%的乳酸平板上，可以明顯看出多數菌株生長都受到不同程度的抑制，其中生長性能比原菌稍好的有菌株L-26和L-38；在0.6%的乙酸平板上，各菌的生長速度都有所減緩且受到不同程度的抑制，其中相對于原菌來說生長性能較好的有菌株L-90和L-130。

2.2 篩選酵母菌株與魯氏酵母和球擬酵母的耐受性對比[14-15]將篩選出的兩株高耐受性酵母L-19和L-38與魯氏酵母和球擬酵母作耐受性對比，結果見圖2。

圖2 篩選酵母菌株和醬油酵母菌株對溫度、NaCl、乳酸、乙酸的耐受性對比Fig.2 Comparison of tolerance of yeast strains screened and soy sauce yeast strains to temperature,NaCl,lactic acid and acetic acid

由圖2可知，菌株L-19和L-38在55℃熱激5 min條件下的生長性能明顯優于魯氏酵母和球擬酵母，在含有6%NaCl的YEPD平板上菌株L-38的生長能力不如魯氏酵母和球擬酵母，在含有5%乳酸和含有0.6%乙酸的板上菌株L-19和L-38的生長狀態均比球擬酵母和魯氏酵母好，同時也可以看出魯氏酵母在含有乳酸和乙酸的平板上生長受到明顯的抑制，生長速度也有所減緩。綜合來說，菌株L-19和L-38對高溫、NaCl、乳酸、乙酸的耐受性較好。

2.3 菌株生長曲線測定

為了能夠更精確的反映出篩選出的兩株酵母菌在含有抑制物平板上的生長性能，對菌株AY12、L-19、L-38、魯氏酵母以及球擬酵母進行了24 h生長曲線的測定。

由圖3a和3b可知，經過55℃熱激5 min以及經過含有酸和鹽培養基培養的菌株與未經過處理的菌株相比，在酵母生長的延滯期明顯受到抑制，進入對數生長期的時間明顯延遲，其中受到最明顯影響的是魯氏酵母和球擬酵母，菌株L-19和L-38進入穩定期時間延長但是后期菌量明顯高于原菌株AY12和其他菌株，說明菌株L-19和L-38的生長狀態最好。

由圖3a和3c可知，在含有6%NaCl的YEPD固體平板上菌株受到的抑制作用最弱，菌的生長速度減緩但不是太明顯，總體來說影響最小，其中菌株L-19和L-38受到的抑制最弱。

由圖3a和3d圖可知，在含有5%乳酸的YEPD固體平板上菌株生長均有所延遲，其中魯氏酵母前期生長幾乎處于停滯狀態，12 h之后生長狀態才慢慢恢復，菌株L-19和L-38與其他菌株相比仍處于優勢狀態。

由圖3a和3e圖可知，在含有0.6%乙酸的YEPD固體平板上菌株的影響最強烈，5株菌的生長都嚴重延遲，后期仍然是菌株L-19和L-38兩株菌生長狀態恢復的最好。

圖3 不同酵母菌的生長曲線Fig.3 Growth curves of different yeasts

3 結論

本實驗通過對實驗室培育得到的7株釀酒酵母的耐高溫，耐鹽和耐酸分析，篩選出兩株高耐性的釀酒酵母L-19和L-38，并通過與魯氏酵母和球擬酵母作耐受性實驗對比來直觀的觀察篩選出菌株的高耐受性，在經過55℃熱激5 min處理以及在含有6%NaCl、5%乳酸和0.6%乙酸的培養基上菌株L-19和L-38無論在菌落形態還是大小都優于魯氏酵母和球擬酵母，而且其生長速率也比魯氏酵母和球擬酵母要高，同時進入對數生長期的時間有所延遲但總體早于魯氏酵母和球擬酵母。因此菌株L-19和L-38具有高耐受性，可以很好的用于食品發酵工業，同時對于工業發酵生產也有重要的應用價值。

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Screening of high toleranceSaccharomyces cerevisiaeand its tolerance

FU Xiaomeng,WANG Pengfei,HAO Aili,HONG Kunqiang,XIAO Dongguang*
(Key Lab of Industrial Fermentation Microbiology of Ministry of Education,College of Bioengineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Adding excellent resistant strains can effectively improve the production efficiency of soy sauce and quality and flavor of products.Two strains of yeast resistant high temperature,hyperosmotic and high acid were screened and were used in the fermentation of soy sauce.The number and morphology of the colonies of different dilutions were compared by the dilution plate after the high temperature heat shock of the yeast,and the tolerance of each strain was compared by the growth on the hyperosmotic plate and the high acid plate and the growth curve determination in the resistance medium.The results of dilute point plate experiments and growth curve showed that the colony morphology and size ofSaccharomyces cerevisiaeL-19 and L-38 in the conditions of 55℃heat shock and solid plate(containing 6%NaCl,0.6%acetic acid and 5%lactic acid)were better than that of soy sauce yeast,and the growth rates ofS.cerevisiaeL-19 and L-38 in a liquid medium containing high salt and high acid were higher than that of soy sauce yeast.Therefore,two strains of yeast with high tolerance were successfully screened.

Saccharomyces cerevisiae;high tolerance;soy sauce fermentation

TS261.1

0254-5071（2017）10-0023-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.006

2017-07-08

“十三五”國家重點研發計劃項目（2016YFD0400505）

付肖蒙（1994-），女，碩士研究生，研究方向為微生物資源的開發與利用。

*通訊作者：肖冬光（1956-），男，教授，博士，研究方向為釀造技術與微生物資源開發利用。