穴位貼敷誘發(fā)小鼠背部接觸性皮炎模型的建立與評(píng)價(jià)?

劉蘭英，吳嘉齡，王和生△，吳文忠，張 聰，劉成勇，秦 珊，陳 棟

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京 210029； 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210000)

【針灸研究】

穴位貼敷誘發(fā)小鼠背部接觸性皮炎模型的建立與評(píng)價(jià)?

劉蘭英1，吳嘉齡2，王和生1△，吳文忠1，張 聰1，劉成勇1，秦 珊1，陳 棟1

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京 210029； 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210000)

目的：探討穴位貼敷誘發(fā)小鼠背部接觸性皮炎模型制備及評(píng)價(jià)方法。方法：以經(jīng)典的2,4-二硝基氟苯 (DNFB)誘發(fā)的小鼠背部接觸性皮炎模型作為參照，制備不同穴位貼敷方法誘發(fā)的小鼠背部接觸性皮炎模型，觀察皮損肉眼下及光鏡下組織病理學(xué)特點(diǎn)。結(jié)果：肉眼下穴位貼敷造模小鼠皮損與DNFB造模小鼠皮損顏色、形態(tài)、質(zhì)地等相似，符合接觸性皮炎肉眼下表現(xiàn)。光鏡下皮損組織病理學(xué)均示穴位貼敷誘發(fā)接觸性皮炎模型小鼠皮損皮膚表皮角質(zhì)層破壞，真皮層炎細(xì)胞浸潤(rùn)與DNFB誘發(fā)接觸性皮炎模型小鼠表現(xiàn)存在高度相似性，符合接觸性皮炎的病理學(xué)改變。結(jié)論：成功建立穴位貼敷誘發(fā)的小鼠背部接觸性皮炎模型，以肉眼下及光鏡下病理作為評(píng)價(jià)方法。

穴位貼敷；接觸性皮炎模型；小鼠

在穴位貼敷治療哮喘的長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中觀察到，相當(dāng)一部分患者在治療過(guò)程中貼敷部位皮膚產(chǎn)生紅斑、丘疹甚至水皰等皮膚反應(yīng)，符合接觸性皮炎表現(xiàn)[1]。本研究前期結(jié)果顯示，穴位貼敷可誘發(fā)患者背部接觸性皮炎[2]。并有臨床研究認(rèn)為，出現(xiàn)皮炎的哮喘患者療效優(yōu)于未出現(xiàn)皮炎的患者[3]。但如何通過(guò)穴位貼敷誘發(fā)小鼠背部接觸性皮炎模型，以模擬人類穴位貼敷所致的背部接觸性皮炎，目前國(guó)內(nèi)外暫未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。本研究擬通過(guò)以經(jīng)典的2,4-二硝基氟苯 (DNFB)誘發(fā)小鼠背部接觸性皮炎模型作為參照，從肉眼皮損及光鏡下皮損病理學(xué)角度評(píng)價(jià)穴位貼敷誘發(fā)小鼠背部接觸性皮炎模型與其相似度，從而評(píng)價(jià)穴位貼敷方法誘發(fā)的接觸性皮炎模型是否成功。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠24只，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2) g，上海靈暢生物科技有限公司提供(許可證號(hào)SCXK[滬]2013-0018，合格證編號(hào)2013001812558)。

1.2 試劑及儀器

DNFB丙酮溶液：將丙酮:橄欖油(化學(xué)純CP，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)Lot.No.20150617)按4∶1作為基液配成0.2%、0.5% 2種濃度的DNFB丙酮溶液(DNFB-A5512為東京化成工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品，批號(hào)Lot.2WTMO-GM)備用，現(xiàn)用現(xiàn)配； 穴位貼敷藥貼：配伍組方源自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院針灸康復(fù)科經(jīng)驗(yàn)方，劑型由本院制劑部制備，將白芥子(2份)、延胡索(2份)、生甘遂(1份)、細(xì)辛(1份)、麻黃(1份)、葶藶子(1份)、丁香(1份)、肉桂(1份)、牙皂(1份)共9味中藥，各自打粉過(guò)80目篩，充分混合，每100 g混合藥粉中加入70 mL鮮生姜汁及30 mL液態(tài)凡士林，混勻后制成直徑0.5×0.5 cm，質(zhì)量約0.5 g的藥帖，置于醫(yī)用膠布上備用；寵物電推剪(深圳科德士電器有限公司，CP5000)。

2 方法

2.1 分組

將BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白組、DNFB模型組、每日貼敷模型組及隔日貼敷模型組4組各6只。

2.2 造模方法

空白組：第1天電推剪于背部3×4 cm范圍去毛之后正常飼養(yǎng)，定期觀察。DNFB組：參考王國(guó)江[4]方法進(jìn)行改良，于背部致敏及激發(fā)并減少刺激量以防止皮損過(guò)重，同空白組去毛備皮，第2天于背部備皮處均勻涂抹0.5%DNFB 25 μl進(jìn)行誘導(dǎo)致敏，第5天于背部致敏處均勻涂抹0.2%DNFB 20 μl進(jìn)行激發(fā)。 每日貼敷模型組：第1天備皮同前，第2天開(kāi)始每天于背部去毛區(qū)(約兩側(cè)膀胱經(jīng)上)貼敷咳喘停藥貼4貼，每次貼敷4 h，用紙膠帶固定，每天1次，共貼敷14 d。隔日貼敷模型組：第1天去毛備皮方法同前，第2天開(kāi)始隔天貼敷藥貼方法時(shí)長(zhǎng)固定同前，隔天1次，共貼敷14 d。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 各組小鼠造模完成后肉眼下皮損特點(diǎn) 觀察時(shí)間DNFB模型組及貼敷模型組于末次激發(fā)及末次貼敷24 h后，空白組觀察時(shí)間同貼敷模型組。觀察小鼠背部皮膚顏色、形態(tài)及質(zhì)地，評(píng)價(jià)穴位貼敷與DNFB誘發(fā)的小鼠背部接觸性皮炎模型相似度。

2.3.2 各組小鼠皮損處鏡下組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 觀察時(shí)間于肉眼觀察完皮損取下制作HE染色后。取材方法：用4%水合氯醛(0.2 ml/20 g)腹腔注射麻醉，待檢處皮膚用醫(yī)用碘伏消毒后在眼科鑷固定下用眼科彎剪剪取0.5×0.5 cm大小的皮膚，用10%中性甲醛液固定脫水、石蠟包埋、切片；行HE染色，在光鏡下觀察各組皮損處皮膚病理學(xué)特點(diǎn)，評(píng)價(jià)穴位貼敷與DNFB誘發(fā)的小鼠背部接觸性皮炎模型相似度。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠造模完成后肉眼下皮損特點(diǎn)

圖1顯示，空白組皮膚紅潤(rùn)、完整，膚質(zhì)柔軟，未見(jiàn)明顯異常；DNFB模型組皮膚腫脹、增厚，質(zhì)地較正常組稍硬，個(gè)別小鼠出現(xiàn)輕微皮損，未見(jiàn)潰爛結(jié)痂等嚴(yán)重皮損表現(xiàn)。每日貼敷模型組小鼠背部貼敷處皮膚中度紅腫，多數(shù)小鼠皮膚可見(jiàn)少量破潰。隔日貼敷模型組小鼠背部貼敷處皮膚輕度的紅腫，少量可見(jiàn)皮膚破潰。

圖1 小鼠造模后皮損部位肉眼觀察注：A.空白組；B.DNFB模型組；C.每日貼敷模型組；D.隔日貼敷模型組

圖2 小鼠造模后皮損組織HE染色(×100)注：A.空白組；B.DNFB模型組；C.每日貼敷模型組；D.隔日貼敷模型組

3.2 各組小鼠造模完成后皮損處皮膚標(biāo)本組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

圖2顯示，空白組小鼠皮膚表皮層及真皮層結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)較多毛囊、皮脂腺及汗腺。DNFB模型組小鼠皮膚表皮層的角質(zhì)層破壞，真皮層的水腫伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維斷裂。每日貼敷模型組小鼠背部貼敷處皮膚造模后表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)紊亂，部分破壞伴增厚，棘層細(xì)胞大量增生，棘層明顯增厚，真皮層大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。隔日貼敷模型組小鼠背部貼敷處皮膚造模后表皮層的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)紊亂，棘層細(xì)胞增生，真皮層水腫伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

4 討論

目前國(guó)內(nèi)外并未見(jiàn)到穴位貼敷方法制作的小鼠接觸性皮炎模型，僅有穴位貼敷方法治療不同疾病模型小鼠的研究[5-9]。經(jīng)典的DNFB誘發(fā)小鼠接觸性皮炎模型已有較為成熟的制備方法[10-11]。有人用DNFB于昆明小鼠腹部誘導(dǎo)制作耳部及背部激發(fā)的小鼠接觸性皮炎模型，成功建立了小鼠的背部接觸性皮炎模型[4]。也有人用DNFB背部致敏與激發(fā)BALB/c小鼠，產(chǎn)生的皮膚組織肉眼及形態(tài)學(xué)特點(diǎn)改變與接觸性皮炎患者表現(xiàn)一致[12]。本實(shí)驗(yàn)旨在建立穴位貼敷方法誘發(fā)的小鼠背部接觸性皮炎模型，以模擬患者背俞穴穴位貼敷治療后產(chǎn)生的接觸性皮炎，故選擇小鼠DNFB背部致敏及背部激發(fā)造模方法制作模型作為參照，以評(píng)價(jià)穴位貼敷方法誘發(fā)的接觸性皮炎模型是否成功。實(shí)驗(yàn)方法擬在王翼騰[13]及李圓圓[14]等多次用DNFB反復(fù)于小鼠背部進(jìn)行激發(fā)后產(chǎn)生較嚴(yán)重的皮膚炎癥變化的基礎(chǔ)上，建立更接近于臨床中患者穴位貼敷誘發(fā)的輕中度接觸性皮炎皮膚反應(yīng)[2]，因此在建立DNFB模型時(shí)進(jìn)行了減少刺激量的改良。有研究顯示，末次激發(fā)后24～48 h時(shí)接觸性皮炎皮膚炎癥表現(xiàn)最明顯[15]，故將實(shí)驗(yàn)觀察點(diǎn)設(shè)于末次激發(fā)24 h后。

本實(shí)驗(yàn)DNFB模型結(jié)果顯示，肉眼下見(jiàn)皮損處皮膚紅腫、增厚，部分小鼠出現(xiàn)皮膚破潰，但未見(jiàn)大面積潰爛結(jié)痂等嚴(yán)重皮損表現(xiàn)。光鏡下示，小鼠背皮損真皮層水腫且炎細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維斷裂，皮膚角質(zhì)層破壞，符合接觸性皮炎的病理學(xué)改變，成功復(fù)制了DNFB致小鼠背部接觸性皮炎模型，可用作穴位貼敷方法造模的參照。

在穴位貼敷誘發(fā)小鼠接觸性皮炎模型制備方法中，參考小鼠穴位貼敷治療方法[8、16-17]及臨床患者穴位貼敷方法[18-19]等，分別采用每日及隔日貼敷，療程選擇為2周。穴位貼敷造模結(jié)果示，肉眼下皮損處皮膚紅腫，部分小鼠皮膚水腫及破潰，可觸及增厚、變硬。每日穴位貼敷模型組較隔日穴位貼敷模型組皮膚皮損及炎癥程度更重。光鏡下皮膚組織形態(tài)學(xué)示，2種穴位貼敷方法均造成小鼠貼敷部位皮膚表皮角質(zhì)層增厚及結(jié)構(gòu)紊亂、棘層增生、真皮層炎細(xì)胞浸潤(rùn)，每日貼敷的角質(zhì)層增厚并結(jié)構(gòu)紊亂及炎癥程度比隔日貼敷的更重。2種穴位貼敷方法均可成功建立穴位貼敷誘發(fā)的小鼠背部接觸性皮炎模型，每日貼敷較隔日貼敷炎癥程度重。該模型可模擬患者穴位貼敷治療后背部接觸性皮炎改變[20-21]，為以后進(jìn)一步研究穴位貼敷誘發(fā)的接觸性皮炎對(duì)哮喘治療作用的效應(yīng)機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

本研究造模關(guān)鍵環(huán)節(jié)包括使用的藥物即喘咳停藥貼中含有白芥子、甘遂、生姜等藥物具有較強(qiáng)的皮膚刺激作用有關(guān)。貼敷頻率選擇上，隔日貼敷所致皮膚反應(yīng)較輕，而每日貼敷所致皮膚反應(yīng)更重。

本研究的不足之處在于，DNFB造模未區(qū)分急慢性接觸性皮炎。本實(shí)驗(yàn)DNFB造模后更接近于急性接觸性皮炎模型，而穴位貼敷造模方法為小劑量多次重復(fù)刺激的慢性接觸性皮炎模型。今后可制作DNFB致慢性接觸性皮炎模型作為參照。

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TheEstablishmentandEvaluationofAMiceModelofBackContactDermatitisInducedbyAcupointSticking

LIU Lan-ying1, WU Jia-ling2, WANG He-sheng1△, WU Wen-zhong1, ZHANG Cong1, LIU Cheng-yong1, QIN Shan1, CHEN Dong1

(1.AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofTCM，Nanjing210029,China; 2.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210000,China)

Objective: To establish and evaluate a mice model of back contact dermatitis which is induced by acupoint sticking. Methods: Compare to the classical contact dermatitis mice model which is induced by 2,4-dinitrofluorobenzene(DNFB), we established a mice model of back contact dermatitis induced by different acupoint sticking methods. We observed the macroscopic and microscopical characteristics of skin lesions with different kinds of acupoint sticking. Results: we found the high resemblance of the color, shape and texture between acupoint sticking models and DNFB model. Acupoint sticking models were highly in accord with DNFB model in the changes of epidermal damage and dermis inflammatory cells infiltration under the light microscope, which fitted in the changes of contact dermatitis. Conclusion:We successfully established a mice model of back contact dermatitis induced by acupoint sticking, the method was evaluated by macroscopic and microscopic pathology.

Acupoint Sticking; Contact Dermatitis Model; Mice

R244.9

A

1006-3250(2017)10-1433-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81674065)-基于Th1免疫應(yīng)答增強(qiáng)探討穴位貼敷誘發(fā)接觸性皮炎對(duì)哮喘氣道炎癥的反向調(diào)節(jié)機(jī)制;江蘇省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(社會(huì)發(fā)展)項(xiàng)目(BE2017771)-基于拉曼光譜原位監(jiān)測(cè)皮炎程度的穴位貼敷技術(shù)治療哮喘的臨床研究；江蘇省中醫(yī)藥局項(xiàng)目(YB2017026)-咳喘停巴布劑穴位貼敷治療哮喘復(fù)發(fā)的中醫(yī)康復(fù)臨床研究

劉蘭英(1974-)，女，重慶人，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事穴位貼敷治療哮喘療效評(píng)價(jià)及效應(yīng)機(jī)制研究。

△通訊作者：王和生(1965-)，男，江蘇人，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事針灸治療呼吸系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床與研究，Tel：025-86617141-31318,E-mail：wanghesheng2010@126.com。

2017-03-08