青藤堿誘導人紅白血病細胞株K562凋亡的實驗研究?

牟鳳林，陳 華

(重慶三峽醫藥高等?？茖W校，重慶 404100)

【實驗研究】

青藤堿誘導人紅白血病細胞株K562凋亡的實驗研究?

牟鳳林，陳 華△

(重慶三峽醫藥高等?？茖W校，重慶 404100)

目的: 通過青藤堿(Sinomeine，SIN)誘導K562細胞凋亡實驗，研究SIN誘導K562細胞凋亡機制。方法: CCK-8檢測細胞增殖，流式細胞術(FMC)檢測細胞凋亡，Hoechst 33258染色細胞凋亡形態學改變，Real-time PCR檢測 bcl-2和bax 基因表達，Western blot檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達。結果: CCK-8和FCM結果顯示，SIN可抑制K562細胞增殖并誘導其早期凋亡；Hoechst 33258染色結果顯示，經SIN誘導48h后表現出細胞凋亡的典型變化；Real-time PCR結果顯示， SIN組bax基因表達升高，bcl-2基因表達降低；Western blot結果顯示，SIN組中Caspase-3、Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低。結論: SIN可誘導K562病細胞凋亡從而抑制細胞增殖。

青藤堿；K562細胞；bcl-2；bax；細胞凋亡

白血病(Leukemia)是一種克隆性起源的造血系統惡性腫瘤[1]，已成為我國年輕人最常見的惡性腫瘤之一[2-3]。目前用于治療白血病的常用方法費用昂貴、毒副作用較大且易產生耐藥性，因此急需探索一種價格合適、毒副作用小、安全高效的抗白血病藥物[4]。青藤堿(sinomenine，SIN)是從原產于中國和日本的植物青風藤中發現的一種生物堿，作為傳統的中藥成分，其化學結構明確，對風濕病和關節炎有較好的療效。最近的研究表明，青藤堿具有抑制腫瘤細胞增殖的作用[5-8]，但其有關青藤堿對白血病細胞作用的相關報道較少。本文通過青藤堿體外誘導人紅白血病K562細胞凋亡的實驗研究，初步探索青藤堿對白血病細胞增殖的抑制作用。

1 材料方法

1.1 藥品與試劑

青藤堿購自成都鉅龍天然藥業生命科技有限公司(純度99%)，紫杉醇(Taxol)購自美國Bristol Caribbean公司，RPMI1640培養基、胎牛血清(FBS)、PBS購自GIBCO公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自日本同仁化學研究所，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；PCR特異性引物由上海英駿生物技術公司合成(中國)，Taq酶、DNase I(RNase free)、RNA提取試劑RNAiso Plus及PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒購自TaKaRa公司，RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑(PMSF)、SDS-PAGE凝膠試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自密理博公司，ECL顯色劑購自美國GE醫療生命科學，兔抗人Bcl-2、Bax多克隆抗體購自宜康生物技術有限公司。

1.2 細胞

人紅白血病細胞株(K562細胞)由重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術研究中心饋贈。

1.3 實驗儀器

CO2恒溫培養箱、MK3酶標儀由美國 ThermoFisher公司生產， DM2500倒置顯微鏡、M70D倒置熒光顯微鏡由德國Leica公司生產，C6流式細胞儀由美國BD公司生產，ABI7500 Real-time PCR定量儀由美國ABI公司生產，Western blot電泳儀由美國BIORAD公司生產。

1.4 方法

1.4.1 青藤堿工作溶液配制 青藤堿分子式C19H23NO4，分子量為329.39 g/mol，取3.23 g青藤堿溶解于1 mL二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，配置成10 mol/L母液，再加9 mL RPMI1640稀釋成1000 mmol/L工作液。

1.4.2 K562細胞培養及分組 取對數生長期的K562細胞，用RPMI1640完全培養液(含5% FBS)懸浮細胞，調整密度5×105/ml，接種于6孔板，每孔4 mL。實驗分組：本底對照組只加RPMI 1640完全培養液，空白對照組加含最大劑量0.1% DMSO的RPMI 1640完全培養液，陽性對照組濃度為0.1 μmol/L紫杉醇(Taxol)處理，藥物組終濃度為1、2、4、8 mmol/L的SIN，在37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養12、24、48、72 h。

1.4.3 CCK-8法檢測K562細胞增殖活性 取對數生長期的K562細胞，調整細胞密度為8×105/ml，接種至96孔培養板，每孔100μL。本底對照組只加RPMI 1640完全培養液，空白對照組加含最大劑量0.1% DMSO的RPMI 1640完全培養液，陽性對照組加0.1 μmol/L的紫杉醇(Taxol)，藥物組終濃度為1、2、4、8 mmol/L的SIN，每組設5個復孔。置于37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養12、24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，輕輕震蕩使之混勻，繼續孵育2 h。用酶標儀在450 nm波長的條件下檢測各孔的吸光度值(A)，同時計算各實驗組細胞增殖的抑制率和各個作用時間點的半數抑制濃度(IC50)，以IC50為標準確定最適合的藥物作用濃度和時間，實驗做3次重復。抑制率(IR%)={1-A450SIN (S)組/A450空白對照組}×100%。

1.4.4 FCM檢測SIN對K562凋亡的影響 收集各組細胞，用PBS(pH7.2)洗滌2次， 1500 r/min離心5 min，100 μL PBS重懸細胞，加20 μL Annexin V-FITC/PI染料，在4 ℃避光的條件下染色處理30 min，染色完成后用PBS洗滌1遍，最后用300μl PBS重懸細胞，每組取1×104個細胞上流式細胞儀做流式檢測，實驗重復3次。

1.4.5 Hoechst 33258染色 培養48 h后，收集空白對照組、陽性對照組和分別經1、2、4和8 mmol/L SIN處理的藥物組細胞，用預冷PBS洗滌細胞2次，加甲醇/乙醇(3∶1)固定液室溫固定15 min；離心去除固定液加Hoechst 33258染色液避光、室溫染色30 min，PBS洗滌1次，再加PBS制成細胞懸液滴在載玻片上，50%甘油封片，置于倒置熒光顯微鏡下觀察、采圖。

1.4.6 Real-time PCR 檢測SIN對K562細胞bcl-2和bax基因表達的影響 收集培養48 h后的各組細胞，按照試劑盒方法裂解細胞提取總RNA，然后逆轉錄合成cDNA第一條鏈，以合成的cDNA作為模板，β-actin基因作為內參基因進行PCR反應。反應條件為：95 ℃ 3min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 cycles。引物序列為：Bcl-2上游引物：GTTTAAATGGGCATTTGTTTGC，下游引物：CCAACCATGGTTGGTCTGC，探針：GAGAGTTCCTCTCTTTCAGC，Bax上游引物：CTGAGCAGATCATGAAGACAG，下游引物：GCTTGAGACACTCGTCAGCTTC，探針：GAGCTGGCCCTGGACCCGGT，β-actin上游引物：GTGATGGTGGGCATGGGTCAG，下游引物：GCAGAAGGTGTGGTGCCAGA，探針：GTACCCCATCGAGCACGGCA。最終數據使用2-△ △Ct公式計算出相對表達量，實驗重復3次。

1.4.7 Western blot檢測SIN對K562細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達的影響 培養48 h后收集各組細胞，用RIPA裂解液提取K562細胞的總蛋白， BCA法檢測各組細胞蛋白的濃度，調節各組蛋白的濃度使其終濃度一致。每組取40 μg的蛋白樣品，進行10% SDS-PAGE電泳，電泳完成后將蛋白電轉移至PVDF膜上，用5% BSA室溫封閉2 h后，用TBST漂洗3次，每次5 min，分別加入1∶2000稀釋的抗Bcl-2、Bax、Caspase-3(激活型)抗體及內參照抗 β-actin抗體，室溫孵育4 h；用TBST漂洗3次，每次5 min，分別加入稀釋度均為1∶1000的二抗，室溫條件下孵育2 h，再用TBST漂洗3次，每次5 min，之后用ECL顯色劑化學發光再用X光膠片曝光顯影，最后掃描儀掃描后用Quantity One軟件進行定量分析，目的蛋白的表達水平用目的條帶與內參的灰度值之比表示，實驗重復3次。

2 結果

2.1 SIN對K562細胞的增殖具有抑制作用

表1顯示，在1、2、4、8 mmol/L的濃度范圍內SIN可以有效抑制K562細胞的增殖，在處理48 h時各組比較差異有統計學意義(P<0.05)。且隨著SIN濃度的增加和作用于細胞時間的延長，抑制作用逐漸增強，8 mmol/L SIN處理組與陽性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。SIN作用K562細胞12、24、48、72 h的半抑制濃度(IC50)分別為9.8、6.8、4.2、3.9 mmol/L。

表1 SIN對K562細胞的增殖抑制作用

注：SIN處理K562細胞后與1 mmol/L比較:*P<0.05

表2 SIN可誘導K562細胞早期凋亡[例(%)]

注：SIN處理K562細胞后與control比較:*P<0.05

2.2 SIN可誘導K562細胞早期凋亡

圖1表2顯示，FCM檢測結果示在 2、4、8 mmol/L的濃度范圍內，SIN作用于K562細胞48 h能夠誘導細胞早期凋亡，并隨著SIN濃度的增高早期凋亡率隨之升高，8 mmol/LSIN處理組與陽性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，與空白對照組早期凋亡率比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 SIN作用48 h后Annexin V-FITC/PI雙染檢測K562細胞凋亡(箭頭所指為凋亡細胞所處位置)注：A.對照組；B.1 mmol/L SIN；C.2 mmol/L SIN；D.4 mmol/L SIN； E.8 mmol/L SIN；F.positive control

2.3 Hoechst 33258染色

圖2顯示，空白對照組的K562細胞發出均勻的淡藍色熒光，細胞核無明顯的凋亡形態學變化；陽性對照組和分別經2、4、8 mmol/L的SIN誘導48 h后，細胞的核染色質濃縮聚集、核碎裂、核邊集，并發出較強的藍色熒光呈亮白色，表現出細胞凋亡的典型變化，且濃度越高變化越明顯。

圖3 Hoechst 33258染色照片(×400)(箭頭所指位置為凋亡細胞群體所處位置)注：A.對照組;B.1 mmol/L SIN;C.2 mmol/L SIN;D.4 mmol/L SIN; E.8 mmol/L SIN;F.positive control

2.4 Real-time PCR 檢測SIN對K562細胞bcl-2和bax基因表達的影響

表3顯示，Real-time PCR示經2、4、8 mmol/L SIN處理48 h后，實驗組K562細胞的bax基因表達與較空白對照組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；8 mmol/LSIN處理組與陽性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。bal-2基因的表達水平較空白對照組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；8 mmol/L SIN處理組與陽性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5 SIN對K562細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達量的影響

圖3表4顯示，K562細胞經 2、4、8 mmol/L SIN作用48 h后，SIN實驗組中Caspase-3和Bax蛋白表達水平顯著高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，8 mmol/LSIN處理組與陽性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；Bcl-2蛋白表達水平顯著低于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，8 mmol/LSIN處理組與陽性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 SIN可誘導K562細胞早期凋亡

注：SIN處理K562細胞后與control比較:*P<0.05

表4 SIN可誘導K562細胞早期凋亡

注：SIN處理K562細胞后與control比較:*P<0.05

圖3 Western blot檢測K562細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達

3 討論

白血病患者造血細胞增殖不受控制，分化成熟及正常的凋亡途徑均受到影響，進而造成大量的異常分化細胞增殖[9]，形成白血病癥狀。目前，白血病的治療方法主要是大劑量聯合化療，但該方法不良反應多，復發率高，因此尋找一種副作用小且對機體免疫和造血系統抑制程度小的新藥是當務之急。

中藥如紫杉醇、人參、當歸、黃芪等具有明顯防治癌癥作用，可顯著延長患者生存期，提高患者生活質量。尤其是紫杉醇是國內外公認的抗癌中藥有效成分，可以通下調Bcl-2、上調Bax和激活Caspase-3來誘導白血病細胞株K562細胞凋亡[10]，故本文用紫杉醇作陽性對照。

青藤堿是從防己科植物青藤干燥藤莖提取的生物堿單體，其化學結構已研究清楚。最近的研究表明，SIN具有抗腫瘤的作用。Jiang等[11]研究發現，SIN可通過增加細胞內Bax蛋白表達，降低Bal-2蛋白的表達來誘導肺癌細胞NCI-H460的凋亡；Li等[12]報道，SIN可以通過MAPK信號通路介導乳腺癌細胞停滯在G1/S細胞周期，從而導致癌細胞死亡；Lv等[13]研究表明，SIN可抑制COX-2的表達抗胃癌細胞SGC-7901的增殖。

本研究使用CCK-8法證實在1-8 mmol/L的濃度內SIN可有效抑制K562細胞增殖，且這一作用呈濃度依賴關系。我們進一步通過Hoechst 33258染色和FCM實驗顯示，SIN可誘導K562早期凋亡，產生抗白血病細胞增殖作用。Bcl-2蛋白為細胞存活促進因子，屬于膜整合蛋白，在一些腫瘤細胞中過度表達；Bcl-2蛋白內定位于細胞核膜、內質網以及線粒體上，通過阻止線粒體細胞色素C的釋放發揮抗凋亡作用；Bax蛋白是Bcl-2家族中參與細胞凋亡的重要成員之一[14]，當細胞受到外界干擾或者刺激發生凋亡時發生遷移、釋放，激活Caspase家族，產生Caspase級聯反應執行細胞凋亡程序[15]；細胞中Bcl-2/Bax的比例決定該細胞是否發生凋亡。本實驗檢測了執行細胞凋亡相關蛋白因子Caspase-3[16-17]和與細胞凋亡相關的Bcl-2家族成員bcl-2、bax基因以及Bcl-2、Bax蛋白[3,18]的表達。Real-time PCR結果顯示，SIN能夠降低bcl-2基因的表達，同時上調bax基因的表達。此外，Western blot結果顯示，SIN 能有效抑制Bcl-2蛋白的表達，增加促凋亡蛋白Bax并激活Caspase-3蛋白表達，從而促進細胞凋亡的發生，并隨著處理濃度的增加該現象越明顯。這與Real-time PCR結果一致。也有文獻報道，SIN 可通過Caspase-3依賴方式誘導腫瘤細胞凋亡[19]。此外也有研究者認為，SIN 可通過提高Bax蛋白的表達，降低Bcl-2蛋白的表達來誘導腫瘤細胞凋亡[20]。

綜上所述，SIN在1、2、4、8 mmol/L濃度范圍內均能有效抑制人紅白血病K562細胞增殖，并通過下調Bcl-2、上調Bax和激活Caspase-3來誘導其早期凋亡，這一研究為青藤堿用于臨床白血病治療提供實驗依據和理論基礎。

[1] 劉玉琴，趙鳳菊，陳萬青，等．中國2009年白血病發病和死亡資料分析[J]． 中國腫瘤， 2013，22(7)：528-534．[2] ZHENBEI GAO, XIAO KANG, JUN HU, et al. Erratum to: Induction of apoptosis with mitochondrial membrane depolarization by a glycyrrhetinic acid derivative in human leukemia K562 cells[J]. Cytotechnology,2013, 65: 895.

[3] FLOREAN C, SCHNEKENBURGER M, GRANDJENETTE C, et al. Epigenomics of leukemia: from mechanisms to therapeutic applications[J]. Epigenomics,2011,3(5): 581-609.

[4] 李丹，余濤，吳杰，等． 中藥有效成分抗白血病機制研究進展[J]．中國藥師，2013，16 (7)：1068-1070．

[5] 陳偉毅，秦春宏，銀曉剛． 青藤堿抗腫瘤作用研究進展[J]．中國藥師，2013，16(12)：1902-1904．

[6] 施榮東．Maspin、Caspase-3、COX-2與宮頸癌的關系及青藤堿與順鉑對其表達的影響[D]．太原：山西醫科大學，2011．

[7] 任強，孫越華，朱清，等．青藤堿抗炎免疫與抗腫瘤作用研究新進展[J]．中國藥理學通報，2015，31(8)：1040-1043．

[8] 謝冰冰，易浪，董燕，等．青藤堿對肺癌細胞A549增殖及α7 nAChR表達的影響[J]． 中藥新藥與臨床藥理，2015，26(2)：164-169．

[9] 何志旭，許威．兒童急性白血病發病機制研究進展[J]．實用兒科臨床雜志， 2011，15：1149-1152．

[10] ROSARIA MR, BARBARA S, ANTONIO B, et al. Late apoptotic effects of taxanes on K562 erythroleukemia cells: Apoptosis is delayed upstream of caspase-3 activation[J]. International Journal of Cancer, 2000,10(1002):527-533.

[11] JIANG T, ZHOU L, ZHANG W, et al. Effects of sinomenine on proliferation and apoptosis in human lung cancer cell line NCI-H460 in vitro[J]. Mol Med Rep, 2010, 3(1): 51-56.

[12] LI X, WANG K, REN Y, et al. MAPK signaling mediates sinomenine hydrochloride-induced human breast cancer cell death via both reactive oxygen species-dependent and independent pathways: an in vitro and in vivo study[J]. Cell Death Dis, 2014, 5: e1356.

[13] LV Y, LI C, LI S, et al. Sinomenine inhibits proliferation of SGC-7901 gastric adenocarcinoma cells via suppression of cyclooxygenase-2 expression[J]. Oncol Lett, 2011, 2(4):74 -75.

[14] MOAZAMI-GOUDARZI M, FARSHDOUSTI-HAGH M, HOSEINPOUR-FEIZI A, et al. The acute lymphoblastic leukemia prognostic scoring whether it is possible by BCL-2, BAX gene promoter genotyping[J]. Caspian J Intern Med,2016, 7(2):105-113.

[15] O’NEILL KL, HUANG K, et al. Inactivation of prosurvival Bcl-2 proteins activates Bax/Bak through the outer mitochondrial membrane[J]. Genes Dev,2016， 30(8):973-988.

[16] DAS C, LUCIA MS, HANSEN KC, et al. CBP/p300-mediated acetylation of histone H3 on lysine 56[J]. Nature,2009,459(7243):113-117.

[17] CHEN J, ODENIKE O, ROWLEY JD. Leukaemogenesis: more than mutant genes[J]. Nat Rev Cancer,2010,10(1):23-36.

[18] HUFFMAN K, MARTINEZ ED. Pre-Clinical Studies of Epigenetic Therapies Targeting Histone Modifiers in Lung Cancer[J]. Front Oncol,2013, 9:235.

[19] 楊海波，施展，馬艷春，等．青藤堿對人結腸癌細胞株SW480增殖和細胞周期的影響[J]．醫學研究雜志，2014，43 (7)：72-75．

[20] 周溯．青藤堿聯合氟尿嘧啶對人胃腺癌SGC7901細胞增殖及凋亡的影響[J]． 蚌埠醫學院學報，2015，8：998-1001．

ExperimentalStudyonApoptosisofHumanErythroleukemiaCellLineK562InducedbySinomenine

MOU Feng-lin, CHEN Hua△

(ChongqingThreeGorgesMedicalCollege,Chongqing404100,China)

Objective: To grope preliminarily the effects of Sinomenine(SIN) on the proliferation inhibition, apoptosis of human erythroleukemia cell line K562. Methods: CCK-8 assay was used to detect the K562 cell proliferation activity. K562 cell apoptotic changes were detected by Flow cytometry (FCM). The cell morphological changes of apoptosis were observed by hoechst staining.The changes of expressions of bcl-2 gene and bax gene were examined by Real-time PCR. The changes of expressions of Bcl-2、Bax and Caspase-3 proteins were examined by western blot analysis. Results: CCK-8 assay result showed that SIN can effectively inhibit the proliferation of K562 cells in vitro, which exhibits a dose-dependent manner. Flow cytometry results indicated that SIN can induce early apoptosis of K562 cells after induced by SIN, which showed statistically significant difference compared with the control group. Hoechst staining revealed that SIN could induce toypical apoptotic morphological changes. Real-time PCR showed that the expressions of bax gene was increased in dose-dependent manner after induced by SIN, while expressions of bcl-2 gene were decreased compared with the control group. Western blot showed that the expressions of Bax, Caspase-3 were increased in dose-dependent manner after induced by SIN, expressions of Bcl-2 proteins were decreased compared with the control group. Conclusion: SIN can inhibit the proliferation of K562 cells and induce its apoptosis through activating Caspase-3 up-regulating the expression of Bax, and down-regulating the expression of Bax.

Sinomenine; K562 cells; bcl-2; bax; apoptosis

R285.5

B

1006-3250(2017)10-1387-04

重慶市基礎與前沿研究計劃項目(cstc2014jcyjA10049)-構建I型大麻受體真核表達體系制備細胞膜色譜篩選中藥中配體的研究；重慶市社會民生科技創新專項細胞色譜篩選新藥技術用于中草藥研發的示范應用(cstc2016shmszx130028)；第二批重慶市高等學校青年骨干教師資助計劃項目(2014)

牟鳳林(1983-)，女，重慶萬州人，副教授，醫學碩士，從事中藥藥理研究。

△通訊作者：陳 華(1964-)，男，重慶萬州人，副教授，醫學碩士，從事生物化學研究，Tel：023-58103698，E-mail：2562307586@qq.com。

2017-04-25