分子診斷在結(jié)直腸癌術(shù)后治療中的應(yīng)用

劉志強，李守淼，張 偉，張志忠，王雁軍，李保中(.安陽市腫瘤醫(yī)院外一科，河南 安陽 455000；.安陽市腫瘤醫(yī)院外四科，河南 安陽 455000)

分子診斷在結(jié)直腸癌術(shù)后治療中的應(yīng)用

劉志強1，李守淼1，張 偉1，張志忠1，王雁軍2，李保中1
(1.安陽市腫瘤醫(yī)院外一科，河南 安陽 455000；2.安陽市腫瘤醫(yī)院外四科，河南 安陽 455000)

目的探討分子診斷在結(jié)直腸癌術(shù)后治療中的應(yīng)用及其意義。方法回顧性分析34例結(jié)直腸癌患者的臨床病理資料，檢測DNA切除修復(fù)交叉互補基因1(ERCC1)mRNA、胸苷酸合成酶(TYMS)mRNA水平以及二氫嘧啶脫氫酶(DPYD)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)基因多態(tài)性。結(jié)果ERCC1、TYMS mRNA高表達分別占67.6%、52.9%，其中ERCC1 mRNA表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目呈負相關(guān)。DPYD、UGT1A1突變率分別為26.0%、30.4%，UGT1A1突變率與腫瘤腫瘤分化程度成負相關(guān)。結(jié)論分子診斷在結(jié)直腸癌術(shù)后治療方案選擇中具有重要指導(dǎo)意義。

結(jié)直腸癌；分子診斷；藥物敏感性；不良反應(yīng)；預(yù)測轉(zhuǎn)移

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，近幾年發(fā)病率居高不下，全球每年新發(fā)病例超過100萬例[1]，2008年WHO數(shù)據(jù)[2]提示北美結(jié)直腸患者5 a生存率61%，而我國結(jié)直腸患者總體5 a生存率僅為32%，遠遠低于北美水平。雖然我國外科手術(shù)技術(shù)已與國際水平基本同步，但是較大差異的生存情況提示結(jié)直腸癌的綜合治療仍然存在較大差距。結(jié)直腸癌治療隨著研究的深入已經(jīng)達到分子水平，不同分子分型、遺傳背景導(dǎo)致不同的預(yù)后，因此如何檢測腫瘤分子類型、選擇合適的治療方法已經(jīng)成為治療不同患者的關(guān)鍵。該研究通過檢測腫瘤基因表達情況來指導(dǎo)術(shù)后用藥，以期達到精確、有效治療。

1 資料與方法

1.1一般資料回顧性分析2012年11月至2013年4月在安陽市腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療后行分子檢測的34例結(jié)直腸癌患者的臨床病理資料，檢測腫瘤組織中DNA切除修復(fù)交叉互補基因1(excision repair cross-complementing, group 1，ERCC1)mRNA、胸苷酸合成酶(thymidylate synthetase，TYMS)mRNA水平,檢測外周血二氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrimidine dehydrogenase gene，DPYD)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(uridine diphosphoglucu-ronosyl transferase 1A1,UGTlA1)基因多態(tài)性。

1.2檢測方法基因表達水平采用分支DNA-液相芯片法，基因多態(tài)性檢測使用xTAG-液相芯片法。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0處理相關(guān)數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用百分數(shù)表示，比較用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1患者一般資料34例結(jié)直腸癌患者均未行術(shù)前放、化療，其中男22例，女12例；年齡27～84(56±14)歲；病程3～1 080(156±223)d；腫瘤最大直徑1～12(5.2±2.6)cm；結(jié)腸癌14例，直腸癌20例；TNM分期:Ⅱ期15例，Ⅲ期14例，Ⅳ期5例。

2.2ERCC1、TYMS、DPYD、UGT1A1與患者臨床病理資料的關(guān)系ERCC1、TYMS mRNA高表達分別占67.6%、52.9%，ERCC1 mRNA表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目呈負相關(guān)(P=0.003)，而與年齡、病程、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、器官侵犯、病理類型、TNM分期無明顯相關(guān)(P>0.05)，TYMS mRNA表達水平與年齡、病程、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、器官侵犯、病理類型、TNM分期無明顯相關(guān)(P>0.05)。DPYD、UGT1A1突變率分別為26.0%、30.4%，UGT1A1突變率與腫瘤腫瘤分化程度成負相關(guān)(P=0.008)。見表1、2。

3 討論

結(jié)直腸癌根治性切除是提高術(shù)后生存率、改善預(yù)后的關(guān)鍵，是目前惟一可以治愈結(jié)直腸癌的方法，1982年Heald等[3]提出全直腸系膜切除術(shù)(total mesorectal excision TME)，顯著減少了直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)，提高了長期生存，從而確立了TME作為直腸癌根治標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式的地位，遵循這種組織胚胎學(xué)的解剖理念， Hohenberger等[4]提出了全結(jié)腸系膜切除術(shù)在結(jié)腸癌根治術(shù)，為結(jié)腸癌根治術(shù)提供了一種新的思路，具體效果有待進一步臨床驗證。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，腔鏡技術(shù)發(fā)展迅猛，但不論是開放手術(shù)還是腔鏡手術(shù)，結(jié)直腸癌根治術(shù)的原則是一致的。但是同樣的手術(shù)方式，結(jié)直腸癌患者生存情況在國內(nèi)與北美存在明顯差異，這種差異與采取不同綜合治療方法有關(guān)。乳腺癌治療模式的成功為其他腫瘤治療提供了新的思路，結(jié)直腸癌不應(yīng)該只看到局部，而應(yīng)該是全身性疾病，術(shù)后綜合治療明顯改善了預(yù)后，但是臨床結(jié)局證明并不是每例患者都能從綜合治療中獲益，甚至嚴重的不良反應(yīng)可能造成不可逆轉(zhuǎn)的后果，因此結(jié)直腸癌綜合治療的個體化選擇顯得非常重要，然而如何既能達到最佳療效又能將不良反應(yīng)降到最低是一個艱難的選擇，如何達到這種平衡困擾著臨床醫(yī)生。生物科技的發(fā)展為分子診斷提供了有效的工具，目前結(jié)直腸癌輔助化療標(biāo)準(zhǔn)方案為奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶類藥物，而含伊立替康和奧沙利鉑的兩藥方案是轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的一線方案，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，越來越多靶向治療開始在結(jié)直腸治療中扮演較多的角色，為此本研究針對這幾類藥物篩選檢測相關(guān)基因，直接為化療藥物敏感性、藥物不良反應(yīng)、靶向藥物的有效性提供了相對科學(xué)的依據(jù)。

表1 ERCC1、TYMS mRNA水平與患者臨床病理資料的關(guān)系

表2 DPYD/UGT1A1基因多態(tài)性與臨床資料關(guān)系

ERCC1的表達水平直接影響DNA修復(fù)的生理過程。臨床研究已證實ERCC1參與鉑類化療藥物耐藥性的發(fā)生，其表達水平與多種惡性腫瘤鉑類化療療效和生存期呈負相關(guān)[5-7]。本研究提示ERCC1高表達占67.6%，2/3的患者在常規(guī)劑量鉑類藥物不能獲益，2010年NCCN臨床實踐指南明確指出：在接受鉑類化療前進行ERCC1 mRNA表達水平檢測可提高治療有效率和患者生存率[8]。ERCC1 mRNA表達水平隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增多表達增高，臨床上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多預(yù)后越差，化療效果越差，但是具體機制還需進一步研究。TYMS基因編碼的胸苷酸合成酶是嘧啶核苷酸合成的限速酶，是腫瘤生長的重要因子，也是5-氟尿嘧啶發(fā)揮化療作用的主要靶點。5-氟尿嘧啶的代謝物與TYMS結(jié)合，阻礙其正常功能，從而抑制DNA的合成。在結(jié)直腸癌中TYMS mRNA表達水平與5-氟尿嘧啶療效呈負相關(guān)[9]。本研究提示52.9%的患者不能在常規(guī)劑量5-氟尿嘧啶治療下獲益，若想獲得理想療效需要提高劑量。盲目提高用藥劑量對患者可能產(chǎn)生難以挽救的損傷，因此，不僅要選擇合適的劑量又要避免較重的不良反應(yīng)。DPD由DPYD編碼，與5-氟尿嘧啶的降解有關(guān)。DPYD基因發(fā)生突變后，會降低該酶的活性，增加氟類藥物的不良反應(yīng)。含伊立替康和奧沙利鉑的兩藥化療方案是轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌標(biāo)準(zhǔn)的一線化療方案，但是聯(lián)合用藥難免要付出更多的不良反應(yīng)代價，因此，檢測伊立替康藥物不良反應(yīng)也顯得尤為重要。伊立替康在體內(nèi)代謝為7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)，SN-38的活性比伊立替康強100到1 000倍。UGT1A1可以使SN-38葡萄糖醛苷化而被滅活，因此降低伊立替康的不良反應(yīng)。UGT1A1的酶活性與其基因多態(tài)性相關(guān)，UGT1A1基因突變會降低該酶的活性，增加伊立替康的不良反應(yīng)[10-12]。本研究結(jié)果提示UGT1A1基因多態(tài)性與腫瘤分化程度有關(guān)，隨著腫瘤分化程度增高UGT1A1突變率降低，但臨床不能因為腫瘤分化程度低而冒險增大伊立替康用藥量。K-RAS基因突變與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，影響了腫瘤細胞的生存、增殖、遷移、擴散、血管生成，K-RAS是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)下游重要分子，因此K-RAS的突變成為靶向治療的關(guān)鍵。研究[13-15]發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者對吉非替尼、厄洛替尼和西妥昔單抗等靶向治療藥物的原發(fā)性耐藥與K-RAS外顯子2第12和13位密碼子的突變有關(guān)。2010年NCCN中明確指出：腫瘤患者接受EGFR靶向藥物治療之前，必須進行K-RAS基因突變檢測，根據(jù)檢測結(jié)果決定是否使用EGFR靶向藥物作為臨床治療措施[8]。最近有研究[16-17]表明，攜帶p.G13D突變的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從一線西妥昔單抗聯(lián)合化療治療中獲益，獲益程度與K-RAS野生型患者相仿。限于靶向治療費用昂貴，此類藥物的檢測受到一定限制。循環(huán)腫瘤細胞的檢測是臨床檢驗的一次革命，其在乳腺癌中的應(yīng)用引起了廣泛注意，2009年被應(yīng)用于結(jié)直腸癌檢測，在術(shù)前分期、術(shù)后治療效果評定中具有重要指導(dǎo)意義[17-19]。

人類基因組計劃的完成，為研究個體之間基因的差異性以及這種差異如何影響不同個體對疾病的敏感性及對藥物的反應(yīng)性創(chuàng)造了條件，液相芯片技術(shù)興起于20世紀(jì)90年代，是一種集合流式細胞技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)字信號處理技術(shù)及傳統(tǒng)芯片技術(shù)為一體的新型生物檢測技術(shù)，被譽為后基因組時代的芯片技術(shù)。本研究采用這一先進技術(shù)發(fā)現(xiàn)ERCC1、TYMS mRNA高表達占據(jù)較大比例，這也就解釋了不同結(jié)直腸癌患者綜合治療效果不同的現(xiàn)象，但是目前本研究樣本量較少，分子診斷在臨床治療方案選擇中的指導(dǎo)意義還待進一步確定。

[1] JEMAL A, SIEGEL R, WARD E, et al.Cancer statistics, 2009[J].CA Cancer J Clin, 2009，59(4):225-249.

[2] COLEMAN MP, QUARESMA M, BERRINO F, et al.Cancer survival in five continents: a worldwide population-based study (CONCORD) [J].Lancet Oncol, 2008，9(8):730-756.

[3] HEALD RJ, HUSBAND EM, RYALL RD.The mesorectum in rectal cancer surgery--the clue to pelvic recurrence[J].Br J Surg, 1982，69(10):613-616.

[4] HOHENBERGER W, WEBER K, MATZEL K, et al.Standardized surgery for colonic cancer: complete mesocolic excision and central ligation--technical notes and outcome[J].Colorectal Dis, 2009，11(4):354-364.

[5] BEPLER G,KUSMARTSEVA I,SHARMA S,et al.RRM1 modulated in vitro and in vivo efficacy of gemcitabine and platinum in non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2006,24(29):4731-4737.

[6] OLAUSSEN KA, DUNANT A, FOURET P, et al.DNA repair by ERCC1 in non-small-cell lung cancer and cisplatin-based adjuvant chemotherapy[J].N Engl J Med, 2006，355(10):983-991.

[7] LORD RV, BRABENDER J, GANDARA D, et al.Low ERCC1 expression correlates with prolonged survival after cisplatin plus gemcitabine chemotherapy in non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res, 2002，8(7):2286-2291.

[8] 陳紹俊,吳夢馨,韋曉謀,等.ERCC1 mRNA表達水平與Ⅱ期鼻咽癌順鉑同步放化療療效相關(guān)性的臨床研究[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2016,29(5)：373-376.

[9] SHIROTA Y, STOEHLMACHER J, BRABENDER J, et al.ERCC1 and thymidylate synthase mRNA levels predict survival for colorectal cancer patients receiving combination oxaliplatin and fluorouracil chemotherapy[J].J Clin Oncol, 2001,19(23):4298-4304.

[10] INNOCENTI F, UNDEVIA SD, IYER L, et al.Genetic variants in the UDP-glucuronosyltransferase 1A1 gene predict the risk of severe neutropenia of irinotecan[J].J Clin Oncol, 2004,22(8):1382-1388.

[12] YAMAMOTO N, TAKAHASHI T, KUNIKANE H, et al.Phase Ⅰ/Ⅱ pharmacokinetic and pharmacogenomic study of UGT1A1 polymorphism in elderly patients with advanced non-small cell lung cancer treated with irinotecan[J].Clin Pharmacol Ther, 2009，85(2):149-154.

[13] VAN ZANDWIJK N, MATHY A, BOERRIGTER L, et al.EGFR and KRAS mutations as criteria for treatment with tyrosine kinase inhibitors: retro- and prospective observations in non-small-cell lung cancer[J].Ann Oncol, 2007,18(1):99-103.

[14] DE ROOCK W, PIESSEVAUX H, DE SCHUTTER J, et al.KRAS wild-type state predicts survival and is associated to early radiological response in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab[J].Ann Oncol, 2008,19(3):508-515.

[16] TEJPAR S, CELIK I, SCHLICHTING M, et al.Association of KRAS G13D tumor mutations with outcome in patients with metastatic colorectal cancer treated with first-line chemotherapy with or without cetuximab[J].J Clin Oncol, 2012,30(29):3570-3577.

[17] CRISTOFANILLI M, BUDD GT, ELLIS MJ, et al.Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer[J].N Engl J Med, 2004,351(8):781-791.

[18] CRISTOFANILLI M, HAYES DF, BUDD GT, et al.Circulating tumor cells: a novel prognostic factor for newly diagnosed metastatic breast cancer[J].J Clin Oncol, 2005,23(7):1420-1430.

[19] COHEN SJ, PUNT CJ, IANNOTTI N, et al.Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer[J].Ann Oncol, 2009,20(7):1223-1229.

MolecularDiagnosticApplicationsinthePostoperativeTreatmentofColorectalCancer

LIU Zhiqiang1, LI Shoumiao1, ZHANG Wei1, ZHANG Zhizhong1, WANG Yanjun2, LI Baozhong1
(1.TheFirstDepartmentofSurgery,theTumorHospitalofAnyang,Anyang455000,China; 2.TheFourDepartmentofSurgery,theTumorHospitalofAnyang,Anyang455000,China)

ObjectiveTo investigate the molecular diagnostic applications and its significance in the postoperative treatment of colorectal cancer.MethodsThe clinical data of 34 cases of colorectal cancer, expression levels of the excision repair cross-complementing, group 1 (ERCC1) mRNA and thymidylate synthetase (TYMS) mRNA, mutation rate of dihydropyrimidine dehydrogenase gene (DPYD), uridine diphosphoglucu-ronosyl transferase 1A1 (UGT1A1) were analyzed retrospectively.ResultsHigh expressions of ERCC1 and TYMS mRNA were 67.6% and 52.9%, ERCC1 mRNA expression level was negatively correlated with the number of metastatic lymph nodes.The DPYD, UGT1A1 mutation rates were 26.0%, 30.4%, the UGT1A1 mutation rate was negatively correlated with tumor differentiation of tumor.ConclusionMolecular diagnostics has the guiding significance in the postoperative treatment of colorectal cancer.

colorectal cancer; molecular diagnostics; drug susceptibility; toxicities; metastasis prediction

劉志強(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤治療工作。E-mail: lewzq@126.com

李保中(1967-)，男，主任醫(yī)師，主要從事胃腸腫瘤個體化治療工作。E-mail：libaozhong99@126.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.05.015

R735.3；R730.4

A

1673-5412(2017)05-0417-05

2016-01-15)