胰島素受體底物1 rs1801278基因多態(tài)性TaqMan—MGB雙熒光探針法的建立與驗證

趙陽陽　許智慧++劉妍++吳榮榮　劉新光　徐東平　韓晉

[摘要] 目的 建立一種適合臨床常規(guī)檢測胰島素受體底物1（IRS1）rs1801278基因多態(tài)性的實驗方法。 方法 隨機收集2015年3月～2016年6月解放軍第三〇二醫(yī)院200名健康體檢者的外周血標(biāo)本，設(shè)計針對IRS1 rs1801278基因多態(tài)性位點的特異性引物和熒光探針，通過TaqMan-MGB實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)法檢測rs1801278基因多態(tài)性，以基因測序法（金標(biāo)準(zhǔn)）進行驗證，同時初步探討IRS1 rs1801278不同基因型在本研究人群中的分布頻率。 結(jié)果 TaqMan-MGB雙熒光探針法鑒別IRS1 rs1801278的3種基因型，與基因測序法結(jié)果一致率為100%。IRS1 rs1801278基因多態(tài)性中T/T、C/T和C/C基因型在本研究人群中的分布頻率分別為0%、1%和99%。 結(jié)論 根據(jù)單核苷酸多態(tài)性基因型特異性探針和引物所建立的TaqMan-MGB熒光探針法能快速有效地進行IRS1 rs1801278基因多態(tài)性分型，結(jié)果可靠，操作易行，然而對中國漢族2型糖尿病患者個體化治療效果的預(yù)測價值有限，不建議臨床常規(guī)開展。

[關(guān)鍵詞] TaqMan-MGB實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)；胰島素受體底物1；2型糖尿病；單核苷酸多態(tài)性；基因型

[中圖分類號] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（c）-0004-05

Establishment and verification of TaqMan-MGB two-color fluorescent probe method for detecting the gene polymorphisms of insulin receptor substrate 1 rs1801278

ZHAO Yangyang1，2 XU Zhihui2 LIU Yan2 WU Rongrong3 LIU Xinguang1 XU Dongping2▲ HAN Jin3▲

1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Medical Molecular Diagnostics Institute of Biochemistry and Molecular Biology， Guangdong Medical University， Guangdong Province， Dongguan 523808， China； 2.Administration Center of Clinical Research， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China； 3.Department of Pharmacy， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China

[Abstract] Objective To establish an experimental method suitable for clinical routine detection of the gene polymorphisms of insulin receptor substrate 1 （IRS1） rs1801278. Methods The peripheral blood samples of 200 healthy controls in 302 Military Hospital of China from March 2015 to June 2016 were collected， the specific primers and fluorescent probe aimed at the polymorphic sites of gene polymorphisms of IRS1 rs1801278 were designed， and the gene polymorphisms of rs1801278 were detected by the TaqMan-MGB real-time fluorescence polymerase chain reaction and validated by gene sequencing method （golden standard）. The distribution frequencies of different genotypes of IRS1 rs1801278 in this population were discussed as well. Results The TaqMan-MGB two-color fluorescent probe method could identify 3 genotypes of IRS1 rs1801278， achieving 100% consistence with gene sequencing method. The distribution frequencies of T/T， C/T and C/C genotypes of gene polymorphisms of IRS1 rs1801278 in this population were 0%， 1% and 99%， respectively. Conclusion The established TaqMan-MGB fluorescent probe method based on the specific probe and primer of single nucleotide polymorphisms is rapid and effective in identifying the genotypes of gene polymorphisms of IRS1 rs1801278， the results are reliable， and the operation is easy， but the predictive value for the individualized therapeutic effect of Chinese Han type 2 diabetes patients is limited， which is not recommended for clinical routine practice.endprint

[Key words] TaqMan-MGB real-time fluorescence polymerase chain reaction； Insulin receptor substrate 1； Type 2 diabetes mellitus； Single nucleotide polymorphism； Genotype

胰島素受體底物1（IRS1）是胰島素受體的酪氨酸激酶底物，是介導(dǎo)胰島素信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵蛋白，與導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)病的胰島素抵抗關(guān)系密切[1]。胰島素抵抗指胰島B細(xì)胞分泌受到干擾，功能減退而不能產(chǎn)生足量的胰島素，表現(xiàn)為早期胰島素相對不足和后期胰島素絕對不足[2]。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是不同個體基因組DNA序列同一位置上的單個核苷酸的差別，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換以及單堿基的插入或缺失等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，rs1801278（C>T）位點基因SNP影響胰島素抵抗過程，參與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展[1-3]。本研究旨在以IRS1rs1801278（C>T）作為研究對象，建立TaqMan-MGB雙熒光探針法，指導(dǎo)2型糖尿病臨床個體化用藥。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

全血DNA提取試劑盒（Qiagen公司，批號51104）；T-easy克隆試劑盒（Promega公司，批號A1360）和JM109感受態(tài)細(xì)胞（Trans公司，批號CD301-02）；質(zhì)粒DNA提取純化試劑盒（Qiagen公司，批號12181）；PCR擴增試劑（Takara公司，批號RR014A）；膠回收試劑盒（Qiagen公司，批號28704）；Probe qPCRSuperMix試劑（Trans公司，批號AQ401-01）；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純，引物及MGB熒光探針由上海生工合成；臺式高速冷凍離心機（Thermo公司）；熒光定量PCR反應(yīng)儀（上海宏石）。

1.2 研究對象

選取解放軍第三〇二醫(yī)院檢驗科2015年3月～2016年6月體檢健康者EDTA抗凝全血標(biāo)本200例，其中男59例，女141例，平均年齡31歲，血常規(guī)和生化各項指標(biāo)都在正常范圍內(nèi)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得研究對象的知情同意，樣本于-40℃保存。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針設(shè)計與合成 從GenBank收錄的人基因組序列中查詢包含IRS1基因的染色體2基因組序列（NG_015830.1），利用Vector NTI分析軟件對其進行比對分析，選擇IRS1基因SNPrs1801278位點設(shè)計雙色6-羧基熒光素FAM（6-carboxy-fluorescein）通道和六氯-6-甲基熒光素（Hexachloro fluorescein）HEX通道特異性熒光MGB探針引物和PCR探針，利用Primer 5.0軟件設(shè)計合成對應(yīng)引物，并由上海生工生物公司合成。引物/探針名稱及序列見表1。

1.3.2 基因組DNA提取 嚴(yán)格按照Qiagen全血基因組DNA提取試劑和說明書操作（該提取試劑盒說明書顯示脂血和溶血對提取DNA幾乎沒有影響），提取的基因組DNA測定濃度和A260/A280 OD值都在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 PCR反應(yīng)總體積50 μL。反應(yīng)條件：94℃ 3 min→（94℃ 35 s→56℃ 35 s→72℃ 20 s）×35個循環(huán)→72℃ 10 min。將擴增片段回收后克隆于PGEM-T Easy載體中，轉(zhuǎn)化到JM109大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞中。挑取經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的單菌落，測序，鑒定序列正確后，通過定點突變將IRS1基因rs1801278位點C/G突變?yōu)锳/T獲得突變質(zhì)粒樣本，提純獲得野生型（C/G）標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和突變型（A/T）標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

1.3.4 IRS1基因rs1801278位點TaqMan-MGB雙熒光探針法的建立與優(yōu)化 以制備的野生型（C/G）和突變型（A/T）標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，對反應(yīng)體系中引物、MGB熒光探針、dNTP、Mg2+的濃度以及退火溫度進行篩選，選擇靈敏度高、背景信號低、擴增熒光信號曲線呈典型S型的反應(yīng)條件作為最適反應(yīng)條件。反應(yīng)條件：94℃ 30 s→[94℃ 5 s→65℃ 30 s（采光）]×40個循環(huán)。結(jié)果判定：根據(jù)典型的特異性擴增曲線判讀相應(yīng)型別，F(xiàn)AM擴增為野生型，HEX擴增為突變型。

1.3.5 IRS1基因rs1801278位點突變TaqMan-MGB雙熒光探針法特異性檢驗 將野生型（C/G）和突變型（A/T）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至相同拷貝數(shù)108 copies/mL[6.02×10的23次拷貝數(shù)/摩爾）×（濃度g/mL）/（MW g/mol）= copies/mL]，按不同百分比混合，用TaqMan-MGB雙熒光探針法檢測，獲取按不同百分比混合的質(zhì)粒擴增曲線。

1.3.6 健康人群樣本檢測及DNA測序驗證 200份樣本提取基因組DNA后，用確定的TaqMan-MGB雙熒光探針法對其進行IRS1基因rs1801278位點分型，將198份擴增曲線顯示為野生型樣本全部測序，同時將應(yīng)用TaqMan-MGB雙熒光探針法檢測結(jié)果為突變雜合型（C/T）的2例外送，要求對目標(biāo)序列SNP位點進行測序檢測，最終兩種方法結(jié)果一致，說明采用TaqMan-MGB雙熒光探針法檢測IRS1基因rs1801278基因多態(tài)性結(jié)果的正確性。

2 結(jié)果

2.1 TaqMan-MGB雙熒光探針法建立及特異性檢驗結(jié)果

野生型質(zhì)粒由FAM熒光探針識別并發(fā)綠光，由通道1接收，在圖1上由直線表示。突變型質(zhì)粒由HEX熒光探針識別并發(fā)粉紅色，由通道2接收，在圖1上由虛線表示。熒光閾值一般在0.12左右，循環(huán)閾值（Ct值）為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號值達(dá)到熒光閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。圖1A為檢測100%野生型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴增曲線，直線在32循環(huán)（循環(huán)閾值）處超過熒光閾值，高幅度上升，虛線一直在熒光閾值下。圖1B為75%野生型質(zhì)粒和25%突變型質(zhì)粒混合擴增曲線，直線和虛線均超過熒光閾值。圖1C為50%野生型質(zhì)粒和50%突變型質(zhì)粒混合擴增曲線，虛線和直線同幅度上升，均明顯超過熒光閾值。圖1D為25%野生型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和75%突變型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒混合擴增曲線，直線和虛線均超過熒光閾值。圖1E檢測100%突變型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴增曲線，虛線在25循環(huán)（循環(huán)閾值）處超過熒光閾值，高幅度上升，直線一直在熒光閾值左右。當(dāng)標(biāo)本為純合突變型（T/T）時，代表HEX信號的虛線上升并超過熒光閾值，代表FAM信號的直線在熒光閾值之下；當(dāng)標(biāo)本為突變雜合型（C/T）時，代表HEX信號的虛線和代表FAM信號的直線均上升并遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于熒光閾值；當(dāng)標(biāo)本為野生型（C/C）時，代表FAM信號的直線上升并超過熒光閾值，代表HEX信號的虛線在熒光閾值之下。endprint

2.2 TaqMan-MGB雙熒光探針法在健康人群IRS1 rs1801278（C>T）多態(tài)性中的檢驗結(jié)果

IRS1 rs1801278（C>T）SNP分型以C/C基因型（野生純合型）為主，占99%；C/T突變雜合型僅檢出2例，占1%；未見T/T突變純合型。見表2。

2.3 基因測序法對突變雜合型和野生型IRS1 rs1801278（C>T）SNP的驗證結(jié)果

測序結(jié)果為反方向測序，原C/T結(jié)果顯示為G/A，如圖2所示，2份用TaqMan-MGB雙熒光探針法檢測的突變雜合型C/T測序結(jié)果顯示為G/A（圖2A），相同方法檢測野生純合型C/C測序結(jié)果顯示為G/G（圖2B），測序結(jié)果與本方法結(jié)果顯示一致。

3 討論

全球糖尿病發(fā)病率達(dá)到3.82億例，估計到2035年將增加到5.92億。其中2型糖尿病最常見，占全世界糖尿病患者的90%[1]。

轉(zhuǎn)染研究表明，IRS1基因的rs1801278（C>T）位點單核苷酸多態(tài)性可使細(xì)胞胰島素刺激信號下降32%，同時通過PI3激酶途徑，使磷脂酰肌醇激酶活性下降36%，IRS1表達(dá)細(xì)胞下降25%，可在正常人和2型糖尿病患者人群中導(dǎo)致胰島素抵抗[2-3]。亞洲人數(shù)據(jù)顯示不同人種正常人群中突變雜合型為1.1%～31.4%，突變純合型為0%～0.69%。不同人種2型糖尿病患者中突變雜合型為1.2%～32.0%，突變純合型為0%～0.84%[4-10]。rs1801278（C>T）位點單核苷酸多態(tài)性在國外報道有較高的變異率，對指導(dǎo)2型糖尿病和妊娠期糖尿病用藥均有一定價值[11-12]，但國內(nèi)相關(guān)研究十分有限，因此開展了此項研究。

臨床上多種檢測方法相繼建立，其中基于凝膠電泳的檢測方法包括限制性片段長度多態(tài)性法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性法、變性梯度凝膠電泳、等位基因特異性PCR[13-14]；基于基因組核酸檢測方法包括TaqMan探針法檢測、實時熒光定量PCR技術(shù)、普通DNA測序法、焦磷酸測序法、高分辨率通解度曲線法、DNA芯片檢測、飛行質(zhì)譜儀檢測[15]。直接測序法是應(yīng)用最為廣泛的經(jīng)典檢測手段，是目前SNP檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其檢測靈敏性較低，所需時間較長。基于凝膠電泳的方法分辨率較低，操作步驟繁瑣，容易污染，不適合大規(guī)模的臨床篩查。基于基因檢測的方法靈敏性高，但需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員[16]。

TaqMan-MGB雙熒光探針法是在TaqMan法的基礎(chǔ)上優(yōu)化而成的SNP檢測方法，使用了MGB標(biāo)記的TaqMan雙熒光探針，在原TaqMan探針熒光淬滅基團旁連上一個MGB分子，該分子可結(jié)合于DNA小溝，大大提高了探針的Tm值，使探針與互補DNA 雙鏈的結(jié)合更為特異。探針能識別單個堿基的變化，在很高的溫度下引物結(jié)合模板效率高，既保證擴增效率，又保證了特異性，最低檢出限為0.01 ng DNA，可保證在樣本量少的情況下亦能取得有效結(jié)果，方法穩(wěn)定，重復(fù)性好，操作簡便，通量高，單批次檢測所需時間為2～3 h，結(jié)果判讀簡單，相比于操作復(fù)雜、耗時的測序等其他SNP檢測方法具有明顯的優(yōu)勢，同時目前熒光定量PCR儀在實驗室應(yīng)用率較高，成本相對其他基因檢測設(shè)備較低[17-19]。因此，檢測IRS1 rs1801278（C>T）的TaqMan-MGB雙熒光探針法適合在臨床中開展。

本研究設(shè)計針對IRS1 rs1801278（C>T）的特異性雙色熒光探針和PCR擴增引物，對rs1801278位點不同基因型能夠快速、有效地鑒別。從200份健康體檢志愿者的基因組DNA中檢測出2份為C/T型，對其目標(biāo)序列IRS1 rs1801278（C>T）進行測序檢測，顯示TaqMan-MGB雙熒光探針法與測序法的一致率為100%，說明本研究建立的TaqMan-MGB雙熒光探針法在檢測IRS1 rs1801278（C>T）基因多態(tài)性方面的可靠性和準(zhǔn)確性與測序法同效。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和SNP檢測技術(shù)的發(fā)展，2型糖尿病個體化治療方面的研究取得了長足進展。在指導(dǎo)2型糖尿病患者胰島素的個體化用藥量方面，對這類患者進行有關(guān)IRS1基因的rs1801278位點SNP的檢測對中國漢族2型糖尿病患者個體化治療效果的預(yù)測價值有限，不建議臨床常規(guī)開展。TaqMan-MGB雙熒光探針法是結(jié)果可靠、操作易行的優(yōu)選方法，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供參考和新的思路。

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（收稿日期：2017-07-20 本文編輯：張瑜杰）endprint