黃酒中不產生物胺乳酸菌的篩選及應用

徐建芬 - 毛杰琪 - 魏曉璐 - 劉雙平,5 -,5

(1. 江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 上海金楓酒業股份有限公司，上海 200063； 3. 無錫市第一中學，江蘇 無錫 214100；4. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122； 5. 國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興 312000) (1. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China; 2. Shanghai Jinfeng Wine Co., Ltd., Shanghai 200063 China; 3. Wuxi No.1 Senior High School, Wuxi, Jiangsu 214100, China; 4. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China; 5. National Engineering Research Center of Chinese Rice Wine, Shaoxing, Zhejiang 312000, China)

黃酒中不產生物胺乳酸菌的篩選及應用

徐建芬1,2XUJian-fen1,2毛杰琪3MAOJie-qi3魏曉璐1,4WEIXiao-lu1,4劉雙平1,4,5LIUShuang-ping1,4,5

(1. 江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 上海金楓酒業股份有限公司，上海 200063； 3. 無錫市第一中學，江蘇 無錫 214100；4. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122； 5. 國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興 312000) (1.NationalEngineeringLaboratoryforCerealFermentationTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China; 2.ShanghaiJinfengWineCo.,Ltd.,Shanghai200063China; 3.WuxiNo.1SeniorHighSchool,Wuxi,Jiangsu214100,China; 4.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China; 5.NationalEngineeringResearchCenterofChineseRiceWine,Shaoxing,Zhejiang312000,China)

為篩選不產生物胺的乳酸菌菌株，對黃酒發酵醪液及米漿水中的微生物進行培養及與分離純化，發現3株菌不具有氨基酸脫羧酶活性，但具有一定的生物胺降解能力。使用黃酒發酵液培養該3株菌，發現在2.50%Vol的黃酒培養液中，3株菌能正常生長；在8.80%Vol黃酒培養液中，菌株5-4和8-3生長能力明顯弱于14-2-1；在15.70%Vol黃酒培養液中，3株菌均受到嚴重抑制。菌株14-2-1生長速率最快，繁殖最旺，經鑒定為植物乳桿菌，同時菌株產酸能力較強，產酸速率也較快，表現出一定的優越性，應用于黃酒釀造中，能有效降低黃酒中生物胺的含量。

乳酸菌；生物胺；篩選；測序；鑒定

黃酒主要是以谷物(南方主要以糯米，北方以黍米和玉米)為原料，麥曲為糖化劑，酒母或活性干酵母為發酵劑，經浸米、蒸煮、發酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存和勾兌而成的一種低酒度(14%～20%Vol)的發酵酒精飲料[1-2]。黃酒發酵是糖化和酒精發酵同時進行的雙邊發酵，同時也是開放式的半固態發酵。微生物的共同作用釀成了黃酒獨特的口感及風味[3]，其中真菌和芽孢桿菌產酶使淀粉糖化，酵母利用糖類代謝產酒精，醋酸菌和乳酸菌產有機酸降低pH。與此同時，發酵過程中存在的有害微生物會代謝產生影響人體健康的物質，生物胺就是其中一種[4]。生物胺主要是由微生物分泌的氨基酸脫羧酶催化游離氨基酸脫羧生成的[4-5]。大量研究[6-9]表明，微生物代謝產生物胺的能力具有一定的特異性，即使同一菌屬的細菌，它們所分泌的氨基酸脫羧酶的種類以及促進產生物胺的能力也大不相同。黃酒中富含多種氨基酸，加上自身特殊的釀造工藝，使得黃酒與其他發酵酒(啤酒、葡萄酒)相比，生物胺含量較高[10]。據報道[11]，一定濃度的酒精(<10%Vol)可以增加氨基酸脫羧酶的活性，而酒精又會抑制胺類氧化酶的活性導致生物胺積累過量，有多種生物胺會引起頭痛、高血壓、惡心和嘔吐等不適癥狀，所以對酒類產品中生物胺的限量標準理應比普通食品更加嚴格。

目前，有效降低黃酒發酵過程中生物胺含量的研究報道相對較少，有學者[12]通過敲除釀酒酵母的特定基因，該基因主要編碼了一種蛋白質水解酶，從而使生物胺含量降低了25.5%。豐富的氨基酸使得黃酒具有多種味覺層次[13-14]，所以降低氨基酸含量可能會使黃酒的品質降低。黃酒中的生物胺主要是由乳酸菌代謝產生的，而乳酸菌可產細菌素，細菌素能夠抑制同種或親緣關系較近的種[15]。因此，如果可以篩得一株既不具氨基酸脫羧酶活性、又能產細菌素的乳酸菌，并將其應用于黃酒釀造中，以最大程度降低黃酒中的生物胺含量。本研究擬從黃酒發酵醪液以及米漿水中篩選一株不產生物胺的乳酸菌，以期今后可將其應用于降低生物胺黃酒的發酵工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

黃酒發酵醪液及米漿水樣品：取自浙江省紹興某黃酒廠；

dNTP、瓊脂糖等分子生物試劑：加拿大BBI公司；

其他試劑：國產分析純；

MRS培養基：參照文獻[16]制備；

液體脫羧酶培養基：參照文獻[17]制備；

生物胺檢測培養基：參照文獻[18]制備；

乳酸菌選擇培養基：MRS培養基中加入10 g/L CaCO3；

乳酸菌傳代培養基：在MRS液體培養基中分別添加終濃度為10 g/L的氨基酸(組氨酸、酪氨酸、纈氨酸、精氨酸、鳥氨酸和賴氨酸)，調pH至6.40，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 不產生物胺乳酸菌的初篩 將樣品按梯度(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7)進行稀釋，各取200 μL涂布于MRS固體培養基，倒置于37 ℃厭氧培養1～2 d。

取上述平板上乳白或灰白、中間凸起的單菌落于乳酸菌選擇培養基上進行劃線分離，倒置于37 ℃厭氧培養1～2 d，挑取其中有溶鈣圈的單菌落進行分離純化[19]，重復多次。觀察并記錄平板上單菌落的形態特征，最后選取具有類似乳酸菌形態的單菌落進行傳代培養，再用液體脫羧酶培養基進行氨基酸脫羧酶活性的檢測。

將菌株以10 mL/L接種于MRS液體培養基中進行活化，37 ℃培養24 h，然后轉接到乳酸菌傳代培養基中，37 ℃培養24 h，傳代培養3次。將傳代3次后的乳酸菌培養液接種于液體脫羧酶培養基中，以不接培養液的培養基為對照。于37 ℃厭氧培養4 d后，觀察顏色變化，黃色為陰性，紅色或紫色為陽性。

1.2.2 不產生物胺乳酸菌的復篩 經1.2.1檢測后，選取較優的10株乳酸菌進行復篩，各取200 μL傳代3次后的培養液涂布于相應的生物胺檢測平板上，倒置于37 ℃厭氧培養24 h，觀察平板顏色變化情況，黃色為陰性，紅色或紫色為陽性。

1.2.3 乳酸菌降解混合生物胺能力的檢測 將1.2.2篩得的乳酸菌活化后，以20 mL/L分別接于pH 5.50的含有7種生物胺(酪胺、精胺、亞精胺、腐胺、尸胺、組胺、色胺，濃度分別為100 mg/L)的MRS液體培養基中[20]，以未接種乳酸菌的培養基做對照(0 h)，置于37 ℃厭氧培養，定時取樣檢測培養液的吸光度OD600及生物胺含量，比較分析乳酸菌降解生物胺的能力。按式(1)計算生物胺降解率。

(1)

式中：

Y——生物胺降解率，%；

W0——對照組中生物胺含量，mg/L；

W1——試驗組中生物胺含量，mg/L。

1.2.4 乳酸菌在黃酒培養液中生長能力的檢測 黃酒培養液：在黃酒發酵過程中，按酒精度取樣3次，盡量使發酵醪酒精度呈梯度變化。將發酵醪經10 000 r/min離心10 min獲得上清液，測定不同發酵醪的基本理化指標，另取200 mL上清液于無菌藍蓋瓶中，于70 ℃殺菌20 min后置于室溫冷卻備用。

將1.2.2篩得的乳酸菌用MRS液體培養基活化后，調整菌液吸光度OD600為0.8，以20 mL/L接種量接種于上述黃酒培養液中，取樣測定培養液的吸光度OD600、還原糖含量、總酸含量和pH，比較分析不同乳酸菌在不同黃酒培養液中的生長能力。

1.2.5 乳酸菌的分子生物學鑒定 提取乳酸菌DNA，并進行PCR擴增。采用50.0 μL反應體系：Master Mix 25.0 μL，引物27f 0.5 μL，引物1492r 0.5 μL，無菌水24.0 μL。引物序列為通用引物序列。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，擴增產物用0.8% 的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并使用QIAquick Gel Extraction Kit回收PCR產物[21]，將所得產物送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。

1.2.6 黃酒釀造工藝 大米浸泡之后進行蒸煮，冷卻后與水、麥曲、酒母、淀粉酶、糖化酶以及乳酸菌擴培液混合落料發酵，水溫控制在24～28 ℃。前酵溫度控制在28 ℃，發酵4 d，每天開耙1次；后酵自然溫度發酵，發酵時間為12～14 d。具體工藝配方見表1。

表1 黃酒釀造的工藝配方Table 1 Technological formula of CRW brewing

2 結果與分析

2.1 不產生物胺乳酸菌的篩選

2.1.1 不產生物胺乳酸菌的初篩 經過多次分離篩選，最終從傳統黃酒發酵醪中分離得到18株乳酸菌，通過液體脫羧酶培養基進行不產生物胺乳酸菌的初篩發現18株菌均無色氨酸和鳥氨酸脫羧酶活性，只有3株菌(14-2-1、4-3和8-4)不具精氨酸脫羧酶活性，菌株14-2-1對6種氨基酸都不具備脫羧酶活性。因為黃酒中精胺含量很少，一般不超過2 mg/L[22]，所以，不以精氨酸脫羧酶活性為主要依據，篩選10株乳酸菌進行下一步試驗。

2.1.2 不產生物胺乳酸菌的復篩 初篩較優的10株乳酸菌產生物胺能力檢測結果見表2。10株乳酸菌中只有菌株14-2-1 不產精胺，其他9株菌產精胺能力各不相同，且10株乳酸菌均不產其他5種生物胺。

傳代3次后的乳酸菌培養液pH變化見表3，菌株14-2-1添加6種氨基酸的菌液pH與其他菌株之間有顯著性差異(P<0.05)，說明其產酸能力較強，表現出一定的優越性。通過產生物胺及產酸能力綜合分析，選取14-2-1、8-3和5-4進行下一步試驗。

? “+”表示反應陽性，“-”表示反應陰性；括號中數字代表產精胺能力強弱，10.0表示能力最強，0.0表示能力最弱。

表3 傳代3次后的乳酸菌培養液pH變化?Table 3 Changes of pH of Lactobacillus culture

? 同列數據上標不同表示數據之間有顯著性差異，P<0.05。

2.2 乳酸菌降解混合生物胺能力的比較

2.2.1 乳酸菌生長曲線 3株乳酸菌的生長曲線見圖1，前12 h乳酸菌處于對數生長期，其中乳酸菌14-2-1和8-3的生長速率較快；乳酸菌14-2-1和5-4在18 h開始緩慢生長進入靜止期和衰亡期，而乳酸菌8-3在12 h就開始進入靜止期和衰亡期；培養結束時，乳酸菌14-2-1的吸光度OD600最大，8-3最小，綜上表明乳酸菌14-2-1生長速率最快，繁殖最旺。

2.2.2 乳酸菌對混合生物胺降解能力比較 3株乳酸菌對混合生物胺的降解能力見表4，其中3株菌均不能降解酪胺和精胺，且對亞精胺都有較強的降解能力，培養結束時降解率分別達71.60%，72.21%，68.14%。乳酸菌8-3對腐胺、尸胺、組胺和色胺有一定的降解能力，降解率分別為2.00%，4.99%，10.04%，17.27%，13.40%；乳酸菌5-4對腐胺、尸胺、組胺和色胺有一定的降解能力，降解率分別為4.63%，24.68%，17.07%，14.44%；乳酸菌14-2-1不具有降解腐胺的能力，但對尸胺、組胺和色胺有一定的降解能力，降解率分別為21.58%，29.71%，8.10%。

圖1 不同乳酸菌生長曲線Figure 1 The growth curve of different Lactobacillus表4 不同乳酸菌對混合生物胺的降解率Table 4 Degradation rate of mixed biogenic amines by different Lactobacillus

%

2.3 不產生物胺乳酸菌的代謝特性分析

酒精會抑制微生物的生長，乳酸菌具備一定的耐酒精脅迫能力,才能保證其在黃酒釀造過程中正常代謝。研究選取3個不同發酵階段(發酵12，22，45 h)的黃酒發酵液培養乳酸菌，3個階段黃酒培養液的理化指標見表5。

表5 不同黃酒培養液理化指標檢測結果?Table 5 Detection results of different fermentation mash

? A、B、C分別代表發酵12，22，45 h 的黃酒醪液。

2.3.1 乳酸菌在黃酒培養液的生長能力比較 在A中培養時，在2.50%Vol的酒精度下，菌株濃度達到相當水平(圖2)，3株菌株均能正常生長代謝。在B中培養時，菌株5-4 和8-3已經受到了抑制，OD600明顯低于菌株14-2-1。在C中培養時，因為酒精度較高(15.70%Vol)，還原糖含量只有6.68 g/L，3株菌均受到了嚴重的抑制，幾乎不再生長，所以在黃酒后酵過程不會對黃酒有太大影響。

2.3.2 乳酸菌14-2-1的產酸特性 將乳酸菌14-2-1用MRS液體培養基培養24 h，對最終培養液進行有機酸含量檢測，以0 h未接種乳酸菌的培養液為對照，結果見表6。乳酸菌14-2-1具有較強的產乳酸能力，并能產生一定的乙酸；同時，培養結束后產生大量氣泡，表明菌株14-2-1屬于異型發酵乳酸菌。

圖2 乳酸菌在不同黃酒培養液中的生長曲線Figure 2 The growth curve of Lactobacillus in different fermentation mash

2.4 乳酸菌14-2-1的分子生物學鑒定

菌株14-2-1經PCR擴增得到的16S rDNA片段，經瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠上出現了一條約1 500 bp的條帶，接著對擴增后的PCR產物進行測序分析。測序結果表明，菌株14-2-1的16S rDNA序列共1 429 bp。用MEGA 7.0軟件和Neighbor-joining法構建系統發育樹見圖3，菌株14-2-1與Lactobacillusplantarumstrain BCH-2的親緣關系較近，可以確定是植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

2.5 植物乳桿菌14-2-1降低黃酒生物胺能力驗證

將植物乳桿菌14-2-1應用于黃酒釀造中，采用傳統浸米釀造工藝進行落料發酵，其中植物乳桿菌14-2-1(MRS液體培養基直接培養獲得的活菌液)的添加量分別為生米質量的0.1，1.0，5.0，10.0，50.0，100.0 mL/kg，以不添加植物乳桿菌為對照樣。不添加乳酸菌的對照組發酵指標與正常釀造黃酒無差異[23]，發酵過程見表7，隨著植物乳桿菌14-2-1添加量的增加，總酸含量越高，還原糖殘留越多，而生物胺含量越低，表明植物乳桿菌14-2-1產酸可有效抑制雜菌的代謝，從而降低黃酒釀造過程中的生物胺含量。

表6 乳酸菌14-2-1的產酸特性Table 6 Acid production characteristic of Lactobacillus 14-2-1 mg/L

表7 不同發酵工藝發酵醪指標的檢測Table 7 Detection results of fermentation mash with different crafts

圖3 基于16S rDNA序列構建的系統進化樹Figure 3 Phylogenetic tree based on the sequence homology of 16S rDNA gene

3 結論

本研究從黃酒發酵醪液中分離、培養純化獲得3株具有一定生物胺降解能力的菌株，其中菌株14-2-1生長速率最快，繁殖最旺。在黃酒發酵液中培養該3株菌，發現在2.50%Vol 的黃酒培養液中，3株菌吸光度OD600達到相當水平，能正常生長；在8.80%Vol黃酒培養液中，菌株5-4和8-3受到一定抑制，吸光度OD600明顯低于菌株14-2-1；在15.70%Vol 黃酒培養液中，3株菌均受到嚴重抑制，幾乎不再生長。其中，菌株14-2-1產酸能力較強，產酸速率較快，表現出一定的優越性，經鑒定為植物乳桿菌，能夠有效降低黃酒中生物胺含量，為今后研究降低黃酒中生物胺含量提供了理論支持。

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StudyonisolationandapplicationoflacticacidbacteriawithoutbiogenicamineformationfromChinesericewine

In order to screen the strains without producing biogenic amines, some microorganisms were isolated from the fermentation mash and rice soaking water of Chinese rice wine. It was found that three strains had no amino acid decarboxylase activity, and had a certain ability of biogenic amines degradation. Moreover, the metabolic characteristics of the three strains were analyzed. The results showed thatOD600of the three strains reached a considerable level in the culture medium of 2.50%Vol. In the 8.80%Vol culture medium, strains 5-4 and 8-3 were inhibited whoseOD600was significantly lower than that of strain 14-2-1. In 15.70%Vol culture medium, the three strains were seriously inhibited and scarcely grew. The strain 14-2-1 identified asLactobacillusplantarumhad better acid production capacity, showing a certain superiority. Therefore, strain 14-2-1 could be used in Chinese rice wine brewing, and effectively reduce the biogenic amines of Chinese rice wine.

lactic acid bacteria; biogenic amine; screening; sequencing; identification

國家自然科學基金面上項目(編號：31771968，31701593, 31571823)；國家重點研發計劃(編號：2016YFD0400504，2017YFD0400103)；江蘇省自然科學基金-面上研究項目(編號：BK20171405，BK20161293)；金山區企業產學研科技成果轉化項目(編號：2016-CXY-01)

徐建芬，女，上海金楓酒業股份有限公司中級工程師，本科。

劉雙平(1986—)，男，江南大學副教授，博士。

E-mail：liushuangping668@126.com

2017—05—10

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.005