γ—聚谷氨酸發酵過程中體積氧傳遞系數的控制

李恩+白雪+冉茂雙+張慧莉

摘要：研究了發酵罐的轉速對γ-聚谷氨酸產量的影響。結果表明，在轉速為500 r/min，體積氧傳遞系數KLa為250 h-1時，供氧比較合適，γ-聚谷氨酸的產量為34 g/L。研究結果為進一步通過改善發酵條件來提高γ-聚谷氨酸的產量奠定了良好基礎。

關鍵詞：轉速；體積氧傳遞系數；γ-聚谷氨酸；發酵；產量

中圖分類號： S188+.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0286-03

收稿日期：2016-04-08

基金項目：國家自然科學基金（編號：21366028）。

作者簡介：李恩（1989—），男，碩士研究生，研究方向為發酵工程。E-mail：932699007@qq.com。

通信作者：張慧莉，副教授，研究方向為發酵工程。E-mail：79105878@qq.com。γ-聚谷氨酸（poly γ-glumatic acid，γ-PGA）是由微生物發酵產生的水溶性多聚氨基酸，由L-谷氨酸、D-谷氨酸通過γ-酰胺鍵結合形成的高分子聚合物，通常相對分子質量在10萬～100萬之間[1]。作為一種新型的綠色環保高分子聚合物，γ-PGA具有對人體和環境無毒害、可降解、可再生的優點，廣泛用作藥物緩釋材料[2]，土壤、沙地的蓄水保水劑[3]，食品的水凝膠[4-5]，化妝品的保濕劑[6]以及高強度纖維[7]等。

微生物發酵過程優化的主要目標在于通過一系列調控措施實現生產菌株和/或產物的高產量、高產率和高生產效率[8]。在此過程中，須要對影響發酵過程的各種因素進行系統分析，包括外因（基于微生物反應原理的培養環境優化技術）和內因（基于代謝特性的分階段培養技術）、外因定量化（基于動力學模型分析的優化和控制技術）和內因定量化（基于代謝通量分析的過程優化技術）等，其中動力學模型和代謝通量分析還可以在優化的基礎上對發酵過程進行預測和驗證[9]。

體積氧傳遞系數KLa是發酵罐放大的重要參數之一，目前大多采用氧電極在動態下測定。由溶氧電極測得的響應曲線使用傳遞函數法估算KLa，須要分別實測2條響應曲線來定KLa，另須計算一階和二階導數[10]。在聚谷氨酸的生物發酵生產過程中，由于聚谷氨酸具有的高黏度的特性，導致了發酵液中后期黏度變大。聚谷氨酸發酵液的這種高黏度的特性給發酵過程中氧傳遞、氣液混合以及熱量傳遞等帶來了很大的困難，因此提高聚谷氨酸發酵中的氧傳遞系數這一問題也成了提高聚谷氨酸發酵水平的主要影響因素[11]。

1材料與方法

1.1菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis C10），為筆者所在實驗室保存菌種。

1.2培養基

種子培養基：10 g/L蛋白胨，5 g/L牛肉膏，10 g/L葡萄糖，5 g/L NaCl，自然pH值；分為固體平面培養基（須加瓊脂粉20 g/L）和液體培養基。

發酵培養基：60 g/L葡萄糖，18 g/L NHCl4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，1.5 g/L KH2PO4，0.04 g/L FeCl3·6H2O，0.104 g/L MnSO4·H2O，0.11 g/L CaCl2，20 g/L檸檬酸鈉和20 g/L谷氨酸鈉。

1.3發酵培養方法

1.3.1菌種活化從甘油管中吸取50～200 μL菌液，稀釋后涂布于平板固體種子培養基上，于32 ℃培養24 h。

1.3.2種子培養使用接種針從種子培養基平板挑取發育良好的單菌落接種于液體種子培養基上，裝液量為30 mL（250 mL搖瓶，下同），于32 ℃、200 r/min培養12～20 h。

1.3.3發酵培養將準備好的種子菌液接種到發酵培養基中，接種量為10%，裝液量為30 mL，于32 ℃、200 r/min培養36～48 h。

1.3.4發酵罐培養方法發酵在15 L發酵罐（SY-3000E，上海世遠生物設備工程有限公司）內進行，裝液量8 L，基本培養基原位蒸汽滅菌115 ℃，20 min，加入單獨滅菌的檸檬酸鈉（20 g/L）、谷氨酸鈉（20 g/L）和NH4CL（18 g/L）溶液。種子D600 nm達到4以上時接入發酵罐，接種量8%～10%；溫度自動控制為32 ℃，通氣量400 L/h，攪拌轉速200～600 r/min。

1.4生物量的測定

細胞密度的測定：以水為空白對照，將培養液液稀釋后用Spectrumlab 22PC紫外/可見光分光光度計于600 nm處測定菌懸液的吸光度。調整稀釋倍數使分光光度計讀數在0.3～0.8之間。

1.5發酵液中PGA產量的測定（稱重法）

取10 mL發酵液，13 000 r/min離心30 min，去除菌體。取5 mL上清液，加入4倍體積甲醇，充分混合，置于4 ℃，30 min。8 000 r/min，10 min離心收集沉淀。棄去上清，沉淀在60 ℃烘干至恒質量。將所用離心管精確稱質量（萬分之一天平），沉淀烘干前后質量相減，即得γ-PGA產量。

1.6葡萄糖含量的測定

采用DNS法進行測定[12]

1.7氧傳遞系數KLa的測定

1.7.1亞硫酸鹽法測定搖瓶體積氧傳遞系數將50 mL 0.4 mol/L 亞硫酸鈉溶液裝入250 mL的三角瓶中，滴入 1 mL Cu2+，取樣m1=2 mL移入裝有20 mL 0.05 mol/L的碘、碘化鉀溶液置于100 mL三角瓶中。

然后將250 mL三角瓶上搖瓶機持續搖150 min后，再取樣m2=2 mL移入另一支裝有20 mL 0.05 mol/L碘、碘化鉀溶液的100 mL三角瓶中。endprint

用0.025 mol/L硫代硫酸鈉標準液滴定，在樣品液顏色由深藍色變成淺藍色時，加入1%淀粉指示劑，繼續滴定至藍色褪去即為終點。

1.7.2用動態法測發酵罐的氧傳遞系數在發酵穩定后溶氧量（DO）穩定下降的階段暫停通氣，并將攪拌暫停，根據培養液中溶氧量變化速率可以求出攝氧率。當液體的溶氧量下降到一定程度時（不應低于臨界溶氧量）恢復通氣，則培養液中溶氧量逐漸升高，最后恢復到原先的水平[13]。

動態法測定時，只需測定1個變量——溶氧量（C）隨時間的變化，因此對于安裝有快速響應復膜氧電極的發酵罐，可以用記錄儀描繪的溶氧量變化曲線（圖1）非常方便地求出。

2結果與分析

2.1用亞硫酸鹽法測定搖瓶體積氧傳遞系數

為了給發酵放大提供依據，首先用亞硫酸鹽氧化法對250 mL錐形瓶溶氧性能進行測定。在裝液量相同（30 mL）的條件下，測定不同轉速下搖瓶的體積氧傳遞系數。結果所示，在裝液量相同的情況下，轉速越高，KLa的值越高，但其增長速度變緩，產量的增加幅度也隨之變小。由表1可知，最合適的轉速為200 r/min，KLa的值為260 h-1左右。

2.2動態法測定發酵罐的體積氧傳遞系數

要將搖瓶中的各項優化條件在大規模培養中完全重現是

2.3.1轉速對產物γ-PGA產量的影響試驗中通過改變攪拌轉速控制不同的KLa值，從而達到控制發酵液的溶氧量水平。發現低溶氧量對發酵不利；隨著溶氧量的提高，聚谷氨酸的產量有明顯增長，發酵時間也進一步縮短。將KLa值控制在 250 h-1 左右時，發酵結果較好（表3）。

2.3.4對底物葡萄糖消耗的影響葡萄糖作為聚谷氨酸發酵的碳源，其消耗曲線可以作為發酵過程的重要標志。低轉速（200、300 r/min）下，由于KLa值的低下供氧不足，菌體的生長緩慢，葡萄糖的消耗隨之放緩。把發酵時間延長至 48 h 結束時，200 r/min轉速下葡萄糖剩余接近2/3， 300 r/min 轉速

下葡萄糖剩余接近1/2。在400 r/min轉速下，隨著KLa值的升高，發酵36 h結束時，葡萄糖剩余僅剩 1/3。而在KLa接近250 h-1（轉速為500、600 r/min）時，葡萄糖在發酵30 h時，接近消耗殆盡（圖4）。葡萄糖的消耗變化曲線從另一方面反映了KLa對發酵的重大影響。

3結論

本試驗進行了聚谷氨酸發酵過程中有關供氧條件的研究。結果表明，在最合適的轉速200 r/min下，KLa的最適值為260 h-1左右。在發酵罐進行放大培養以后，得到最合適的發酵罐轉速為500 r/min，此時KLa的最適值為250 h-1左右，兩者經過相互驗證，證明在提高轉速的情況下，KLa和產物γ-PGA的增長都極為有限。本研究為后期改良發酵條件來提高γ-PGA產量奠定了良好基礎，但是在此基礎上從錐形瓶的30 mL擴大到發酵罐的8 L培養體系的過程中，發酵罐產量只有錐形瓶產量的60%左右，還有進一步提升的空間。今后，將研究其他發酵條件對聚谷氨酸的產量影響的工作。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.17.075endprint