基于快相熒光的高等植物光合速率測量儀設(shè)計

覃志松+趙南京+殷高方+石朝毅+甘婷婷+肖雪+段靜波+張小玲++陳雙+劉建國+劉文清

摘要：通過對植物葉綠素?zé)晒獾臏y量，可以實時獲得植物生理狀態(tài)信息。為了得到植物光合作用速率，通過對光合作用的電子傳遞進(jìn)行分析，設(shè)計基于快相熒光技術(shù)高等植物速率測量儀。利用高速脈寬可調(diào)技術(shù)產(chǎn)生激發(fā)光信號，并利用高速采樣技術(shù)獲得微秒量級的快相熒光曲線，最后利用滑動窗口和最小二乘算法在數(shù)字信號處理器（DSP）平臺上計算獲得光合作用參數(shù)最小熒光產(chǎn)率（Fo）、最大光熒光產(chǎn)率（Fm）等信息，并基于光合作用吸收模型計算植物的光合速率（JVPSⅡ）。通過對高溫脅迫條件的高等植物光合參數(shù)進(jìn)行測量，結(jié)果表明，可以獲得光化學(xué)效率產(chǎn)率（Fv/Fm）、光合速率（JVPSⅡ）連續(xù)變化趨勢，F(xiàn)v/Fm與國外的PAM技術(shù)測量結(jié)果線性相關(guān)性達(dá)到0.982，該測量儀為研究植物光合作用提供了一種新的測量手段。

關(guān)鍵詞：光合速率測量；快相熒光；非負(fù)最小二乘算法；葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)

中圖分類號： X835文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0230-04

作者簡介：覃志松（1977—），男，廣西容縣人，博士，講師，主要從事熒光檢測技術(shù)研究。E-mail：zsqin@aiofm.ac.cn。

通信作者：趙南京，博士，研究員，主要從事環(huán)境污染光學(xué)與光譜學(xué)監(jiān)測新技術(shù)與方法研究。E-mail：njzhao@aiofm.ac.cn。光合作用測量的方法包括直接測量法、間接測量法。直接測量法依據(jù)光合作用過程CO2+2H2O→CH2O+O2+H2O，通過測量光合作用過程中反應(yīng)物消耗速率或產(chǎn)物生成速率反映其生理狀態(tài)[1-2]。常用測量方法是測量有機物的積累速率、CO2氣體交換或光合放氧來反演光合作用速率[3]。20世紀(jì)30年代，Kautsky發(fā)現(xiàn)葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象[4]，以后國內(nèi)外學(xué)者對該現(xiàn)象進(jìn)行了深入研究，發(fā)展并形成了光合作用熒光誘導(dǎo)理論，成為研究植物光合作用快速而有效的探針[5]。目前廣泛使用Water-PAM作為測量系統(tǒng)[6-8]，其原理根據(jù)Schreiber等提出的脈沖振幅調(diào)制技術(shù)（pulse amplitude modulation，簡稱PAM），該技術(shù)使用飽和脈沖光還原全部PQ和PSⅡ初級電子受體來測量植物光合作用可變熒光產(chǎn)率Fv/Fm參數(shù)[9]。1992年Kolber等提出高速重復(fù)脈沖技術(shù)（fast repetition rate，簡稱FRR），使用快速光脈沖光激發(fā)誘導(dǎo)熒光產(chǎn)率曲線來反演出光合作用細(xì)節(jié)參數(shù)：功能吸收截面σPSⅡ和QB氧化還原時間τQA進(jìn)行反演[10]；2014年石朝毅等提出了可變光脈沖誘導(dǎo)熒光的檢測方法[11]，對激發(fā)條件進(jìn)行了詳細(xì)的分析。

由于快相熒光技術(shù)可在微秒量級的時間分辨率下獲得熒光快速變化曲線，瞬時的激發(fā)條件可獲得更高的信噪比[11]；同時由于測量時間足夠快，使得測量光合系統(tǒng)Ⅱ時，避免了光合系統(tǒng)Ⅰ的電子傳遞影響，使得測量的光合作用參數(shù)更加準(zhǔn)確。因此本研究采用快相熒光技術(shù)研制植物光速率測量系統(tǒng)，其主要思路是通過應(yīng)用高速采樣技術(shù)獲得熒光動力學(xué)曲線，利用非線性回歸分析算法反演獲得Fo、Fm、Fv/Fm，再根據(jù)吸收模型獲得植物光合速率參數(shù)。

1基本原理

光合作用的實質(zhì)是電子傳遞過程，圖1詳細(xì)闡述了電子傳遞和熒光激發(fā)原理[5]。光照后，PSⅡ反應(yīng)中心發(fā)生原初電荷分離產(chǎn)生強氧化劑P680+，電子傳遞至QA，形成1個相對穩(wěn)定的還原劑QA-；在PSⅡ電荷分離產(chǎn)生1個非常穩(wěn)定的還原劑鐵硫蛋白（FeSX-）和1個弱氧化劑（P700+）。具強氧化勢的P680+可以使水放出1個電子，而QA-具有的還原勢驅(qū)動電子“下山”傳遞，最終傳給P700+1個電子。電子傳遞過程中在光合膜兩側(cè)建立的質(zhì)子梯度驅(qū)動ATP的合成。PSⅡ電子傳遞過程中存在2個重要的時間節(jié)點：QA到PQ需要100～200 μs，PQ達(dá)到PSⅠ幾百微秒到幾十毫秒。

單周轉(zhuǎn)強光激發(fā)后，PSⅡ大量吸收電子導(dǎo)致在QA處阻塞，反應(yīng)中心關(guān)閉，無法再接收后續(xù)的能量用于光化學(xué)反應(yīng)，其光能僅能以熱量、熒光的形式耗散，引起熒光產(chǎn)率從靜態(tài)最小熒光Fo上升并達(dá)到最大熒光產(chǎn)率Fm，葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)率與激發(fā)光能量、PSⅡ的功能吸收截面σPSⅡ及QA的氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)。根據(jù)FRR原理，光系統(tǒng)在強光激發(fā)下，時刻t與熒光產(chǎn)率函數(shù)可由式（1）表示[12]：

f（t）=Fo+（Fm-Fo）[1-exp（-σPSⅡt）]。（1）

式中：Fm為反應(yīng)中心完全關(guān)閉后的最大熒光產(chǎn)率；Fo為最小熒光產(chǎn)率；Fv=Fm-Fo是最大可變熒光產(chǎn)率；C（x）=exp（1-σPSⅡx）為關(guān)閉的PSⅡ反應(yīng)中心比例；σPSⅡ為PSⅡ功能吸收截面。通過式（1）可獲得光化學(xué)效率產(chǎn)率Fv /Fm、功能

吸收截面σPSⅡ等光合作用參數(shù)。

根據(jù)光合作用模型，獲得了上述的光合參數(shù)后，即可根據(jù)光量子吸收模型[13]對光合速率進(jìn)行計算，由式（2）表示：

JVPSⅡ=Fm·FoFm-Fo·Fv′Fm′·KRELED·E。（2）

式中：Fo、Fm為在暗適應(yīng)下由式（1）計算得到；Fm′、Fv′（Fm′-Fo）′為在光適應(yīng)條件下計算獲得；ELED、KR分別表示LED的光照度[以單位時間、單位面積內(nèi)的通過的光量子數(shù)計，單位：μmol/（m2·s），下同]和光譜糾正系數(shù)，這2個參數(shù)可以采用光譜儀進(jìn)行測定；E表示環(huán)境光照度，可以使用光傳感器來獲得該參數(shù)，因而光合速率即可根據(jù)式（2）計算獲得。

2系統(tǒng)設(shè)計

光合速率測量儀構(gòu)架如圖2所示，主要包括光學(xué)結(jié)構(gòu)、激發(fā)單元、發(fā)射單元和程序算法控制等內(nèi)容。

光源采用單個激發(fā)波長為560 nm的激光二極管，最大瞬時光照度為30 000 μmol/（m2·s）。由于激發(fā)光具有發(fā)散角度，為更好地匯聚到光纖內(nèi)，采用透鏡組將其調(diào)成平行光后入射到光纖。光纖有15根細(xì)光纖組成，分別由6根激發(fā)光纖、9根熒光光纖組成，并設(shè)計為“Y”形結(jié)構(gòu)，在1/4處將15根光纖匯成整體結(jié)構(gòu)。光纖的剖面結(jié)構(gòu)如圖3所示，由于激發(fā)光強較為集中，而熒光的發(fā)射是向各個方向分散發(fā)射，為更好地收集熒光，激發(fā)光纖置于內(nèi)部，而熒光光纖則均勻放置在外圍。為了減少激發(fā)光的反射，設(shè)計專用的葉片夾，除了能將外界光照屏蔽以便更好地進(jìn)行暗適應(yīng)外，還可以將葉片平整地放置后，將光纖固定并與葉片呈45°。激發(fā)光經(jīng)玻璃濾光片BG39（截止波長650 nm）對樣品激發(fā)產(chǎn)生熒光，葉綠素?zé)晒庑盘栐?85 nm效率較高，因此使用帶寬為10 nm的帶通濾波片HB680對熒光濾波再進(jìn)行熒光檢測。endprint

激發(fā)單元由數(shù)字信號處理器（DSP）產(chǎn)生高速可調(diào)脈寬信號，并由驅(qū)動器（TC4421A，MICROCHIP）驅(qū)動激光二極管產(chǎn)生激發(fā)光信號。TC4421A是強電流緩沖器/驅(qū)動器，能夠用9.0 A的峰值電流驅(qū)動容性負(fù)載，可以驅(qū)動大功率N-MOSFET（IRF640，Vishay），可以滿足光脈沖的調(diào)制需要。由于瞬時電流可高達(dá)十幾安培，為提供足夠強的激發(fā)光強，電路采用3個300 μF并聯(lián)作為儲能元件。有激發(fā)單元產(chǎn)生的快相激發(fā)光強范圍從 2 400～30 000 μmol/（m2·s），最小分辨率為1 200 μmol/（m2·s）。

熒光采用電倍增管模塊（H6779-1，濱松公司）進(jìn)行信號探測，它包括1個金屬封裝的光電倍增管（PMT）和1個高壓模塊，在685 nm處約為25 mA/W。控制電壓為0.80 V時，探測器電容為10 pF，暗電流為0.4 nA，電流增益約為60 dB，上升時間為0.78 ns，響應(yīng)特性完全滿足測量要求。

獲得熒光電流信號以后，采用500 MHz寬帶高速放大器OPA637完成I/V轉(zhuǎn)換，并由DSP內(nèi)置的高速12位ADC完成轉(zhuǎn)換并保存在SRAM器件中，作為算法程序的熒光信息。控制和計算過程采用高性能DSP芯片（MK60FX150，F(xiàn)reescale），該DSP芯片采用單指令周期，最高處理速度達(dá)210 MIPS，滿足本測量系統(tǒng)的時間要求。該單片機采用Cortex-M4內(nèi)核，集成有16通道的高精度12位A/D模數(shù)轉(zhuǎn)換器，采樣速率可達(dá)1.0 MSPS，可滿足本研究的高速采樣和數(shù)據(jù)計算的要求。

光照參數(shù)采用光學(xué)材料窗口集成的光傳感（NHZD210，武漢中科），量程范圍為0～2 000 lx，DSP使用RS485通信接口與傳感器連接。通過讀指令將光照參數(shù)讀入并保存在DSP的內(nèi)存中，作為計算光合速率的其中1個參數(shù)。

2.2計算流程

參數(shù)的計算基于嵌入式DSP系統(tǒng)，由于復(fù)雜的非線性擬合算法不適用在本系統(tǒng)上運行，本研究對快速下降法進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)熒光產(chǎn)率曲線采用線性擬合極值法對Fo、Fm進(jìn)行估計，代入式（1）擬合獲得Fo、Fm和σPSⅡ，結(jié)合環(huán)境光照實時曲線計算測量區(qū)間的瞬時光照度Et，結(jié)合LED激發(fā)光譜曲線計算獲得Ek（即ELED）和KR參數(shù)，應(yīng)用式（2）即可獲得該時刻的光合速率JVPSⅡ，詳細(xì)計算流程如圖3所示。

3結(jié)果與分析

基于快相熒光動力學(xué)原理研制的高等植物光合作用參數(shù)

測量系統(tǒng)實物如圖4所示，主要部分由主機、“Y”形導(dǎo)入光纖、樣品夾組成，質(zhì)量約為3.0 kg，適合進(jìn)行野外進(jìn)行植物光合作用測量操作。可以對植物快相熒光動力學(xué)曲線進(jìn)行測量和分析，獲得光合作用細(xì)節(jié)參數(shù)Fo、Fm、Fv/Fm參數(shù)，其中 Fv/Fm 與采用PAM技術(shù)的國外商業(yè)化儀器 Mini-PAM作對比分析驗證。

高溫脅迫對高等植物光合葉片系統(tǒng)產(chǎn)生及其重要的影響，長時間的脅迫會導(dǎo)致光合系統(tǒng)Ⅱ和光合系統(tǒng)Ⅰ的電子傳遞收到嚴(yán)重破壞，主要表現(xiàn)為光合作用速率持續(xù)下降[14-15]，F(xiàn)v/Fm和Y（Ⅱ）和Y（Ⅰ）迅速下降[19]。高溫脅迫試驗選用筆者所在實驗室培育的綠蘿（Epipremnum aureum），其平均光照度約25.0 μmol/（m2·s），綠蘿屬常綠藤本且氣根發(fā)達(dá)，生長在溫度較為恒定的環(huán)境中，平均生長溫度在20 ℃左右。高等植物光合參數(shù)測量，由于溫度條件相比其他脅迫如水分、營養(yǎng)鹽、重金屬和毒性試驗條件較為容易建立，因此本研究采用溫度脅迫條件，對高等植物光合參數(shù)變化趨勢進(jìn)行測量和分析。將儀器和綠蘿植株都置于恒溫箱中，設(shè)定溫度從20 ℃至60 ℃，通過人工調(diào)控20個檔位，每檔依次升高2.0 ℃。測量周期為30 min/次，測量前進(jìn)行20 min的暗適應(yīng)時間。通過連續(xù)監(jiān)測獲得的光合作用參數(shù)變化趨勢如圖5所示。

從圖5-a可知，在常溫25 ℃下，F(xiàn)v/Fm比較平穩(wěn)，隨著溫度的上升，F(xiàn)v/Fm呈現(xiàn)下降趨勢。最終溫度在50 ℃的時候已經(jīng)減弱到0.437，表明植物的光合系統(tǒng)已經(jīng)受損嚴(yán)重。其測量結(jié)果與Mini-PAM結(jié)果一致，線性相關(guān)系數(shù)為0.982（圖5-b）。通過對比主要的參數(shù)Fo、Fm和Fv/Fm等，證明本研究的光合速率測量儀的有效性。

4結(jié)論

本研究基于快相熒光動力學(xué)原理研制了植物光合作用速率測量系統(tǒng)，應(yīng)用分支光纖方式對激發(fā)光與熒光進(jìn)行收集，設(shè)計快相熒光硬件檢測電路，應(yīng)用快速下降法算法對熒光曲線反演獲得光合作用參數(shù)信息， 并結(jié)合環(huán)境光照信息計算獲得

植物的光合速率。將獲得的光合參數(shù)與PAM技術(shù)進(jìn)行了對比，結(jié)果表明具有較好的一致性，本研究成果為植物光合作用研究提供了一種新的測量手段。

致謝：衷心感謝國家環(huán)境保護環(huán)境光學(xué)監(jiān)測技術(shù)重點實驗室以及國家環(huán)境光學(xué)監(jiān)測儀器工程技術(shù)研究中心為本研究工作開展所提供的技術(shù)與平臺支持。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.17.062endprint