活性維生素D3對UUO模型大鼠腎間質骨形成蛋白-7表達的影響 ①

劉艷姝，劉中柱，史為伍，牛效清，張國艷，趙春艷，蔡天蕊

(佳木斯大學附屬第一醫院腎內科，黑龍江 佳木斯 154003)

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活性維生素D3對UUO模型大鼠腎間質骨形成蛋白-7表達的影響①

劉艷姝，劉中柱，史為伍，牛效清，張國艷，趙春艷，蔡天蕊

(佳木斯大學附屬第一醫院腎內科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：研究活性維生素D3在腎小管間質纖維化病理過程中對骨形成蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)表達的影響。方法：36只清潔級雄性Wistar大鼠，隨機分為活性維生素D3治療組(n=12)、UUO模型組(n=12)、假手術組(n=12)。活性維生素D3治療組給予羅蓋全(骨化三醇)灌胃，持續28d。假手術組及UUO模型組給予等量生理鹽水灌胃。實驗結束時，測定各組大鼠血清肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)值，腎臟病理檢查造模側腎小管間質纖維化程度，免疫組化法測定BMP-7在各組大鼠造模側腎臟的表達。結果：①UUO模型組的腎間質纖維化面積高于活性維生素D3治療組(P<0.05)。②BMP-7在假手術組明顯高于UUO模型組和活性維生素D3治療組，而活性維生素D3治療組的BMP-7的表達高于UUO模型組(P<0.05)。結論：①BMP-7參與了腎間質纖維化的發生發展。②活性維生素D3可以上調BMP-7的表達，抑制腎間質纖維化。

腎間質纖維化；單側輸尿管梗阻；骨形成蛋白-7；活性維生素D3

腎間質纖維化(RIF)是由多種致病因子共同作用，導致細胞外基質(ECM)的合成與降解失衡為主要特征,最終引起腎間質纖維化。腎間質纖維化是腎小管上皮細胞、血管內皮細胞損傷，發生腎間質炎癥反應，炎癥細胞浸潤，促使產生過多的ECM成分，ECM合成和降解的動態平衡被破壞，導致腎間質ECM積聚,促進纖維化的發生發展[1]。BMP-7在腎臟發育過程中的主要是誘導間充質細胞向正常腎組織結構的轉化[2]，是重要的腎臟保護細胞因子。活性維生素D3經典作用是參與體內鈣磷代謝調節。近年研究發現，活性維生素D3能夠減輕腎小管間質纖維和纖維化，延緩腎功能減退等作用。本實驗通過建立單側輸尿管梗阻大鼠模型，造成大鼠腎間質纖維化，并給予活性維生素D3干預治療，觀測腎臟病理變化、免疫組化結果及對腎臟組織中BMP-7表達的影響，為活性維生素D3在慢性腎臟疾病中作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物模型的建立及分組

36只Wistar雄性大鼠，體重180～220g，隨機分為3組，活性維生素D3治療組(n=12)、UUO模型組(n=12)、假手術組(n=12)。將各組大鼠稱重，進行5%的水合氯醛6mL/kg腹腔注射麻醉，備皮消毒后行腹中線左側切口，游離左側腎臟及輸尿管，并于輸尿管上1/3處手術縫線上下結扎兩處，手術后將腎臟置于原位,逐層縫合。假手術組分離輸尿管不做結扎，手術過程與其它兩組相同。活性維生素D3治療組給予活性維生素D33ng/100g溶于0.1mL花生油中每日灌胃一次，假手術組和UUO模型組給予每日一次0.1mL生理鹽水灌胃，直到實驗結束。各組大鼠分別各取6只于單側輸尿管結扎術后第14、28天測量大鼠體重、內眥靜脈取血1～2mL，送實驗室測定Scr和BUN，然后處死大鼠，迅速取出左側腎臟，去除被膜，延冠狀位縱行切開， 10%中性福爾馬林固定液固定，48h石蠟包埋，將腎組織切成切片。

1.2 腎功能指標

血液標本送佳木斯大學附屬第一醫院生化室，檢測血肌酐、血尿素氮。

1.3 腎臟的病理學檢查及免疫組化染色

將石蠟包埋的腎組織，做2μm連續切片分別進行HE、Masson 染色。每只動物的切片隨機取20個視野，之后取視野的中央，在200倍鏡下留取圖像。計算每個視野下藍染區域占總視野面積的百分比，取均值。采用SABC法測定腎組織中BMP-7的表達，DAB棕黃色反應呈陽性。細胞漿著棕黃色者為陽性表達細胞。BMP-7蛋白表達：隨機選取15個高倍鏡視野(×400)，分析每個視野下棕黃色累積光密度值，計算均值。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 梗阻側腎臟組織大體觀察

假手術組大鼠腎臟組織紅潤，大小正常。UUO 組和活性維生素D3治療組梗阻側腎臟體積明顯增大，縱向剖開后，可見腎內積水，積液清亮透明，可見血塊以及黃色半透明的液體，腎實質變薄，腎盂腎盞高度擴張，穹隆部乳頭變平鈍，腎盞乳頭受壓，部分凹陷。

2.2 各組大鼠血肌酐、血尿素氮結果

各時間點血肌酐、血尿素氮水平活性維生素D3治療組與假手術組、UUO組之間差異無顯著性(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血肌酐、血尿素氮結果±s)

2.3 各組大鼠腎臟病理檢查結果

HE染色鏡檢結果：假手術組腎小球、小管結構正常，小管周圍腎間質無增寬。UUO模型組和活性維生素D3治療組在術后第14天，光鏡下可見腎間質增寬、腎小管結構紊亂、變形，多數小管擴張、灶性萎縮，腎小管上皮細胞彌漫性腫脹、空泡變性。術后28d，小管周圍腎間質明顯增寬，有散在或多灶性單核、淋巴細胞浸潤增多和間質纖維化程度加深。活性維生素D3治療組，在術后第14天、28天都有腎間質增寬，炎癥細胞浸潤，與UUO模型組相比，同時間點腎小管間質病變程度減輕。

Masson染色鏡檢結果：活性維生素D3治療組與UUO模型組在同時間點相比，間質增寬程度、腎小管擴張和膠原沉積程度都顯著減少(P<0.05)，見表2。

表2 大鼠體內Masson染色腎間質纖維化面積百分比±s)

*與假手術組比較，P<0.05，#與UUO模型組比較，P<0.05。

2.4 免疫組織化學結果半定量分析

假手術組中，大鼠腎間質BMP-7高度表達。與假手術組同時間相比，UUO模型組隨梗阻時間延長，BMP-7表達逐漸降低。活性維生素D3治療組BMP-7表達也有降低，但明顯高于同時間點UUO模型組(P<0.05)。見表3。

表3 免疫組織化學各組BMP-7陽性表達面積百分比±s)

*與假手術組比較，P<0.05，#與UUO模型組比較，P<0.05。

3 討論

腎間質纖維化是各種腎臟疾病慢性進展直至終末期的共同病理表現，同時也是所有腎臟疾病慢性發展的最終結果。涉及多種細胞、細胞因子、生長因子、細胞外基質及其相互作用，刺激系膜細胞產生大量致纖維化因子，加重腎間質纖維化。我們在以往的研究中發現，活性維生素D3治療UUO大鼠腎組織結締組織生長因子表達減少，腎間質纖維化程度下降[3]。

本實驗中，假手術組大鼠腎間質BMP-7高度表達，主要分布于腎小管及腎間質，在升支小管上皮、遠曲小管、集合管均有表達，髓質區表達明顯高于皮質區的表達。UUO模型組與假手術組同時間相比，隨梗阻時間延長，BMP-7表達逐漸降低，有些陽性區轉陰。說明BMP-7參與了腎間質纖維化的過程。BMP-7是常見的抑制纖維化因子， BMP-7的表達與TGF-β1和腎間質纖維化程度呈負相關，隨梗阻時間的延長，表達逐漸減少。

BMP-7對腎臟的保護機制可能是①維持腎小管上皮細胞表型：研究表明，腎小管上皮細胞向間充質細胞的轉分化作用在腎間質纖維化中有重要作用[4]，而BMP-7可在基因水平上拮抗TGF-β1，恢復腎小管上皮細胞的表達,抑制EMT的發生。②促進細胞外基質的降解：體外實驗的腎小球系膜細胞中，加入TGF-β1后,纖連蛋白和膠原纖維等細胞外基質的增強，同時加入BMP-7則抑制TGF-β1誘導的細胞外基質的表達,而細胞外基質的mRNA水平并未發生明顯變化,說明BMP-7主要在細胞外基質的降解方面，拮抗TGF-β1的作用。此外，BMP-7還可能通過抑制炎癥反應、改善血流動力學，減輕腎纖維化和腎臟保護作用[5]。

本實驗通過將實驗大鼠左側輸尿管結扎，引起腎臟泌尿系統的阻塞，腎皮質血流量降低，腎臟發生應激反應，大量細胞因子被激活發生相應作用。隨著梗阻時間延長，纖維化程度加深。與UUO模型組相比，活性維生素D3治療組的病理改變減輕，免疫組化測定BMP-7的表達增加，說明活性維生素D3具有保護腎臟作用，可能通過上調BMP-7延緩腎間質纖維化的進程。維生素D可調節免疫功能，調節RAS系統，抑制炎癥因子表達和炎癥反應，通過調節SmaD3和轉化生長因子通路，減少促纖維生成細胞因子的產生[6]。

通過本實驗，我們推論活性維生素D3對腎間質纖維化模型大鼠的防治作用機制之一可能是上調BMP-7的表達，對腎間質纖維化有防治作用。

[1]劉艷姝，劉文思，劉中柱,等.活性維生素D3抑制UUO模型大鼠腎間質纖維化的研究及其對TGF-β1、α-SMA表達的影響[J].黑龍江醫藥科學， 2013,36(2)：72-73

[2]Zeisberg M,Kalluri R.The role of epithelial-to-mesenchymal transition in renal fibrosis[J].J Mol Med,2012,82(3):175-181

[3]劉艷姝，于曉崴，劉中柱，等.CTGF在單側輸尿管梗阻大鼠腎組織中的表達及活性維生素D3干預治療的研究[J].黑龍江醫藥科學，2012,35(4)：22-23

[4]LiT,Surendran K,ZawaidehMA,et al.Bone morphogenetic protein 7:a novel treatment for chronic renal and bone disease[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2010,13(4):417-422

[5]Norman J T,Clark I M,Garcia P L,Hypoxia promotes fibrogenesis in human renal fibroblasts[J].Kidney Int,2010,58(4):2351-2366

[6]Wang S,Hirschberg R.Bone morphogenetic protein-7 signal transforming growth factor beta in mesangial cells[J].BiolChem,2011,279(22):232-236

The influence of active vitamin D3on the expression BMP-7 in UUO model rat

LIUYan-shu,LIUZhong-zhu,SHIWei-wu,NIUXiao-qing,ZHANGGuo-yan,ZHAOChun-yan,CAITian-rui

(Department of Nephrology,the First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China)

Objective：To observe the expression and distribution of the Bone morphogenetic protein-7(BMP-7) in kidney tissues in the process of renal interstitial fibrosis; to explore the influence of active vitamin D3on renal tubule interstitial fibrosis and on the expression BMP-7 in UUO model rat.Methods:36 SD rats were randomly divided into active vitamin D3treatment group (n=12),UUO model group (n=12),sham operated group (n=12).The expression and distribution of the BMP-7 in the kidney tissues were detected by immunohistochemistry.Results:The expression of BMP-7 decreased in UUO model group and in active vitamin D3treatment group compared with the tofsham operated group.The expression of BMP-7 in UUO model group was lower than that in the active vitamin D3treatment group(P<0.05).Conclusion：①BMP-7 take part in renal interstitial fibrosis.②Active vitamin D3can increase the expression of BMP-7 and relieve renal interstitial fibrosis.

renal interstitial fibrosis; unilateral ureteral obsrtution; bone morphogenetic protein-7; active vitamin D3

黑龍江教育廳科研項目，編號：12531702。

劉艷姝(1971～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫師，碩士研究生導師。

R693

A

1008-0104(2016)05-0021-03

2015-10-15)