瑤山雞TRHR基因編碼區序列SNP檢測及其與繁殖性狀的相關性

伍革民+徐龍鑫+朱麗莉+唐繼高

摘要：為探明促甲狀腺激素釋放激素受體基因TRHR（thyrotropin-releasing hormone receptor，TRHR）與瑤山雞繁殖性狀的關聯性，以找出可作為瑤山雞繁殖性狀選育的重要標記，采用PCR產物測序法對促甲狀腺激素釋放激素基因TRH（thyrotropin-releasing hormone，TRH）編碼區進行序列變異檢測，并與繁殖性狀進行關聯分析。結果表明，在瑤山雞群中，TRHR基因檢測到5個編碼區變異位點和1個內含子變異位點，5個編碼區變異位點均能引起蛋白質相應氨基酸發生同義突變；統計分析表明，6個位點與300日齡產蛋量、首次就巢日齡、首次就巢持續時間和就巢次數等性狀均沒有顯著關聯性；初步說明，該基因不能作為瑤山雞繁殖性狀選育的候選基因開展輔助選育，但可以作為雞生長性狀的候選基因開展進一步研究。

關鍵詞：促甲狀腺激素釋放激素受體基因（TRHR）；遺傳變異；荔波縣瑤山雞；繁殖性狀；選育；變異位點；同義突變

中圖分類號： S831.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0047-03

荔波縣瑤山雞原產于貴州省黔南布依族苗族自治州荔波縣，該雞具有耐粗飼、抗逆性強、適應性強、飼料報酬高、肉質鮮美細嫩等特點，是貴州地方雞種中生長發育較快的雞種之一。荔波縣瑤山雞年產蛋量僅90枚左右，具有較強的就巢性。目前筆者針對荔波縣瑤山雞已經開展了多個世代的常規選擇育種，產蛋量從90枚提高到110枚左右，但后期進展相當緩慢，繼續常規選育，產蛋量沒有明顯提高。因此，筆者開展了一些與繁殖性狀相關的候選基因遺傳檢測，試圖探尋有效的輔助選育標記。促甲狀腺激素釋放激素受體基因TRHR（thyrotropin-releasing hormone receptor，TRHR）是筆者選擇的候選基因之一。TRHR受體主要分布于垂體促甲狀腺激素細胞和促乳素細胞膜表面，是下丘腦—垂體—性腺軸中的激素之一[1]。促甲狀腺激素釋放激素TRH（thyrotropin-releasing hormone，TRH）發揮生物功能均須通過與其靶細胞表面的TRH受體（TRHR）結合，以激活胞內第2信使通路[2-3]。TRHR蛋白序列高度保守，雞的TRHR蛋白質結構和功能有相當大的進化約束，其蛋白質序列與鼠沒有明顯差異[4]。TRHR基因結構在不同物種中存在差異，如大鼠TRHR全部編碼序列位于同一外顯子上，而小鼠蛋白編碼區則分布于2個外顯子上，內含子靠近蛋白末端，人的TRHR蛋白編碼區也由2個外顯子組成，但內含子位于第5與第6跨膜螺旋之間的第3胞內環上[5]。雞的TRHR基因編碼區包括2個外顯子，基因序列全長>13 819 bp，mRNA序列全長1 182 bp，2個外顯子中間分布有12 637 bp的內含子序列。文獻搜索沒有發現雞的TRHR基因序列變異或差異表達與繁殖、生長等表型性狀的相關報道，對NCBI數據庫進行雞的TRHR基因的單核苷酸多態性（SNP）搜索，沒有檢索到雞中該基因的SNP登記，本研究針對該基因編碼區設計引物，采用PCR產物回收后直接測序法，檢測瑤山雞群體該基因編碼區的序列變異情況，并與部分繁殖性狀進行關聯分析，以探討其作為繁殖性狀輔助選育基因的可行性。

1材料與方法

1.1荔波縣瑤山雞

試驗雞為120日齡荔波縣瑤山雞母雞，60羽，選自貴陽市烏當區百宜鄉洛壩村種雞場，均采用常規飼養管理，個體籠養，群體一致性較好，性能較為穩定。翅下靜脈采血1.0～1.5 mL，加EDTA-Na2抗凝，-20 ℃保存。

1.2性狀測定

120日齡母雞轉入產蛋舍單只籠養至300日齡，測定或觀測開產日齡、開產體質量、就巢性等繁殖性狀，測定方法按照NY/T 823—2004《家禽生產性能名詞術語和度量統計方法》[6]進行。

1.3基因組DNA提取及引物設計

采用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒提取血樣DNA。根據GenBank中雞的TRHR基因編碼區序列合成2對引物（天根生化科技有限公司），引物信息見表1。

1.4PCR擴增及測序

PCR反應體系：DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR MasterMix試劑10 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應參數：95 ℃預變性6 min，95 ℃變性30 s，特定溫度（表1）退火30 s，72 ℃延伸45 s），35個循環；最后72 ℃延伸 10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用PCR產物回收試劑盒回收PCR產物后委托諾賽基因組研究中心有表1引物信息

引物序列

（5′→3′）擴增長度

（bp）位置位點退火溫度

（℃）P1F：GCGACGAGCAGAACCATACT；R：GCAAACTGCTGTTCCTACCT797第1外顯子、部分內含子17～81358P2F：TCCTTTTCAGCCCAGGTCATT；R：TTGGCAGGTTTCTTGTCCCG632部分內含子、第2外顯子13 051～13 68260

限公司對60個樣本進行測序檢測。

1.5統計分析

使用DNAstar軟件對測序結果進行校正，進入基因庫網站采用Blast分析序列SNPs，采用DNAMAN軟件分析SNPs變異導致蛋白質編碼變異的情況。以Excel軟件統計60羽雞TRHR基因分型，利用PopGen32軟件分析群體多樣性，利用SPSS 18.0軟件采用單因子方差分析方法分析基因型與繁殖性狀的相關性。

2結果與分析

2.1序列變異檢測和群體遺傳多樣性

60羽瑤山雞中共檢測到6個變異位點；5個位點位于第1外顯子區，基因位置分別為249、252、291、411、705位置，變異分別引起蛋白質第83、84、98、137、235氨基酸位置發生同義突變；1個位點位于內含子區；第2外顯子區沒有檢測到核苷酸變異（表2）。對各位點在瑤山雞群體的遺傳多樣性分析結果表明，各位點平均雜合度在0.39～0.50之間，多態信息含量在0.31～0.37之間，遺傳多樣性處于中等水平。哈迪溫伯格平衡的卡方檢驗結果表明，各位點均沒有偏離平衡狀態（P>0.05，表3）。

2.2變異位點基因型與繁殖性狀的相關性

變異位點基因型與個體繁殖性狀的單因素方差分析F檢驗結果見表4，均值描述及基因型間多重比較結果見表5。從表4、表5可知，本次檢測到的TRHR基因編碼區的5個變異位點和內含子區的1個變異位點基因型間開產日齡、300日齡產蛋量、首次就巢日齡、首次就巢持續時間、首次就巢至重新開產間隔以及300日齡就巢次數等繁殖性狀差異不顯著，位點變異與上述繁殖性狀無顯著性關聯。

3結論與討論

候選基因鑒定法是分析數量性狀基因的重要方法之一。TRHR主要分布于垂體促甲狀腺激素細胞和促乳素細胞中，是下丘腦-垂體-性腺軸中的激素之一[1]。免疫組織化學方法研究表明，TRHR激素在獼猴子宮中表達，對子宮功能有直接作用[7]。定量PCR表明，豬TRHR基因在腦、垂體和睪丸中表達[8]。筆者推測，TRHR可能與性腺功能有關，因此，筆者把TRHR基因作為雞繁殖性狀關聯的候選基因之一，開展序列變異檢測并與繁殖性狀關聯研究。結果表明，在瑤山雞群體檢測的該基因5個編碼區變異點和1個內含子變異點與300日齡產蛋量、就巢性狀等沒有顯著關聯性，說明該基因不能用于瑤山雞繁殖性狀輔助選育的候選基因。在雞中，該基因序列變異或差異表達與表型性狀的關聯研究沒有檢索到相關文獻報道，但在其他動物中有相關研究報道，這些報道主要集中于對生長性狀的研究。報道發現，人類TRHR基因突變造成中樞性甲狀腺功能減退綜合征，患者表現出生長發育遲緩、矮胖和行動遲鈍等癥狀[9]。TRHR基因在一項全基因組關聯分析中被指出與人類瘦體質量個體變異有顯著關聯[10]。研究表明，TRHR基因多態性對豬個體頭質量和胴體長有顯著效益，與系水力、肌內水分和肌內脂肪等肉質指標有顯著關聯[3]。高密度SNP芯片檢測結果表明，1個拷貝數變異多態區域上游的TRHR基因可能通過骨骼肌的發育調控作用，影響羔羊生長發育性狀[11]。上述試驗表明，該基因有可能是生長發育性狀的一個候選基因，本試驗初步否定了該基因作為繁殖性狀選育的候選基因，但不排除該基因作為雞生長性狀的候選基因開展進一步試驗，本研究為該基因在雞中的研究提供了理論思路。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.17.013