大鼠骨髓間充質干細胞對不同品系小鼠移植皮膚存活時間的影響及機制

郝貴亮，解童玲，李玉奎，楊宗軍

(1青島市婦女兒童醫院，山東青島266000；2寧夏醫科大學總醫院)

大鼠骨髓間充質干細胞對不同品系小鼠移植皮膚存活時間的影響及機制

郝貴亮1，解童玲1，李玉奎2，楊宗軍1

(1青島市婦女兒童醫院，山東青島266000；2寧夏醫科大學總醫院)

目的探討經尾靜脈注射大鼠骨髓間充質干細胞(BMMSC)對不同品系小鼠移植皮膚存活時間的影響及機制。方法分離SD大鼠BMMSC培養至第3代。用皮膚取樣器切取60只ICR乳鼠圓形皮片(直徑12 mm)，將其移植至成年C57BL/6小鼠背部，建立不同品系小鼠間皮膚移植免疫排斥模型。將60只模型小鼠隨機均分為PBS組及低、中、高劑量BMMSC組，分別經尾靜脈注射PBS、5×104個BMMSC、10×104個BMMSC、20×104個BMMSC各0.2 mL。記錄各組移植皮膚存活時間。術后第7天，HE染色觀察移植皮膚病理組織學變化；每組隨機取5只小鼠處死取其脾臟組織及血清，分別用RT-PCR及ELISA法檢測IL-10、TNF-α、IFN-γ。結果中、高劑量BMMSC組皮膚存活時間較PBS組、低劑量BMMSC組長(P均<0.05)；中、高劑量BMMSC組皮膚存活時間比較，P>0.05。術后第7天，病理切片鏡下觀察顯示PBS組炎性細胞浸潤最明顯，高劑量BMMSC組炎性細胞浸潤最少。術后第7天，與PBS組比較，低、中、高劑量BMMSC組脾臟組織TNF-α、IFN-γ mRNA相對表達量低(P均<0.05)。與PBS組比較，中、高劑量BMMSC組血清IL-10水平高(P均<0.05)，低、中、高劑量BMMSC組血清TNF-α、IFN-γ水平低(P均<0.05)；與低劑量BMMSC組比較，中劑量BMMSC組血清TNF-α、IFN-γ水平低(P均<0.05)，高劑量BMMSC組血清IL-10水平高、TNF-α水平低(P均<0.05)。結論經尾靜脈注射適當劑量的大鼠BMMSC可延長不同品系小鼠移植皮膚存活時間；該作用可能與BMMSC調控受體小鼠IL-10、TNF-α、IFN-γ的表達有關。

皮膚移植；骨髓間充質干細胞；免疫排斥；小鼠

大面積燒燙傷發生后，快速有效封閉創面可減少感染、休克等的發生，并提高患者生存率，皮膚移植是有效封閉創面的重要手段之一。臨床用于移植的皮膚主要有三個來源：自體、異體和異種。對大面積燒燙傷患者來說，自體皮膚移植往往不足，而后兩者會發生嚴重的排斥反應。燒燙傷患者在2～3周進入全身感染的高峰期，此時有效皮膚覆蓋是治療成功的關鍵。異種移植皮膚的臨時覆蓋時間僅為2周，同種異體皮膚也僅3周。如何延長異體移植皮膚的存活時間是皮膚移植亟待解決的問題[1]。骨髓間充質干細胞(BMMSC)具有低免疫原性和抑制免疫排斥等作用。2014年8月～2016年3月，本研究構建不同品系間小鼠皮膚移植的免疫排斥模型，經尾靜脈注射BMMSC至模型小鼠體內，觀察移植皮膚的存活時間，并進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器來源 SD大鼠(雄性、6～8周齡、體質量120～150 g)、ICR乳鼠(雄性、2～4日齡、體質量2～3 g)、C57BL/6小鼠(雌雄各半、8～10周齡，體質量18～22 g)由寧夏醫科大學實驗動物中心提供；DMEM、FBS購自Gibco公司；PBS購自Hyclone公司；TRIzol購自Invitrogen公司；多聚甲醛、水合氯醛、蘇木素、伊紅、無水乙醇等購自生工生物有限責任公司；ELISA試劑盒購自博士德生物有限公司；反轉錄試劑盒、ROX qPCR Master Mix(2×)、3423型CO2培養箱購自Thermo公司；CKX41型倒置顯微鏡購自Olympus公司；IQ5型熒光定量PCR儀、680型酶標儀購自Bio-Rad公司。

1.2 BMMSC分離、培養及鑒定 根據文獻[2]利用梯度離心和貼壁法分離培養SD大鼠BMMSC，培養至第3代時利用流式細胞儀檢測BMMSC CD73、CD105、CD45、CD90、CD14、CD34、HLA-DR的陽性率。分離后的BMMSC在體外培養24 h后已有部分貼壁，培養至第3代時，BMMSC呈條索狀排列，流式細胞儀鑒定結果顯示： CD73、CD105、CD90陽性率均在95%以上，而CD14、CD34、HLA-DR、CD45陽性率均低于5%，證明分離培養的細胞為BMMSC[3]。

1.3 不同品系間小鼠皮膚移植免疫排斥模型建立 按文獻[4]方法，用皮膚取樣器切取60只ICR乳鼠圓形皮片(直徑12 mm)，置于PBS中備用。4%水合氯醛腹腔注射麻醉C57BL/6小鼠，在其背部靠近左前肢處剪取直徑12 mm左右全層皮膚缺損，將ICR乳鼠皮片覆蓋在C57BL/6小鼠皮膚缺損處，建立不同品系小鼠間皮膚移植免疫排斥模型，凡士林紗布覆蓋后創可貼包扎固定。造模后將60只C57BL/6 小鼠隨機分為PBS組、低劑量BMMSC組、中劑量BMMSC組和高劑量BMMSC組，每組15只；分別注射PBS、5×104個BMMSC、10×104個BMMSC、20×104個BMMSC各0.2 mL。術后從第3天開始拆包觀察移植皮膚排異情況并拍照。從手術之日起至移植皮膚出現變硬、發黑、壞死、翹起或脫落中的任一現象的面積大于50%的時間為移植皮膚存活時間，面積計算方法采用畫表格法進行統計。

1.4 移植皮膚病理組織學觀察 術后第7天，每組隨機取5只小鼠，切取移植部位皮膚用4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水、二甲苯透明，浸蠟后行石蠟包裹切片，置于65 ℃烘箱2 h后經二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水行HE染色，中性樹脂封片后顯微鏡下觀察并采集照片。

1.5 模型小鼠脾臟組織白細胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)mRNA表達檢測 采用RT-qPCR技術。術后第7天，每組隨機取5只小鼠，脫臼法處死后取其脾臟。TRIzol法提取脾臟組織總RNA，按試劑盒說明書經65 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min在PCR儀中反轉錄合成cDNA。RT-qPCR法按95 ℃ 3 min ，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環， 72 ℃10 min。根據公式2-△△Ct計算IL-10、TNF-α、IFN-γ mRNA相對表達量，引物序列由生工生物有限責任公司合成。IL-10正義鏈：5′-AGACAATAACTGCACCCACTTCC-3′，反義鏈：5′-GTCGGTTAGCAGTATGTTGTCCAG-3′；TNF-α正義鏈：5′-CCAGGTTCTCTTCAAGGGACAA-3′，反義鏈：5′-GGCAGAGAGGAGGTTGACTTTC-3′；IFN-γ正義鏈：5′-GTGGCATAGATGTGGAAGAAAAGA-3′，反義鏈：5′-GCTGAAGAAG-GTAGTAATCAGGTGTG-3′；β-Actin正義鏈：5′-GAG-ACCTTCAACACCCCAGC-3′，反義鏈：5′-GGAGAGCATAGCCCTCGTAGAT-3′。

1.6 模型小鼠血清中IL-10、TNF-α、IFN-γ檢測 采用ELISA法。術后第7天，每組取5只小鼠，摘除眼球取血，4 ℃過夜，離心分離血清，按試劑盒詳細說明書檢測小鼠血清中IL-10、TNF-α、IFN-γ。

2 結果

2.1 各組移植皮膚存活情況 術后小鼠運動飲食正常，24 h開始小鼠有大量出汗現象。PBS組術后第3天，3只小鼠移植皮膚出現發黑壞死；第5天，8只小鼠壞死面積已超過50%。低劑量BMMSC組術后第3天，2只小鼠移植皮膚出現發黑壞死；第5天，6只小鼠移植皮膚壞死面積大于50%。中劑量BMMSC組術后5天，皮膚紅潤，無發黑、壞死、翹起、脫落等現象；第6天，開始出現較弱的排異反應；第9天，7只小鼠移植皮膚出現變硬、壞死等面積達50%。高劑量BMMSC組術后第5天，移植皮膚紅潤柔軟，無排異反應發生；第9天，8只小鼠移植皮膚發黑、壞死面積超過50%。PBS組、低劑量BMMSC組、中劑量BMMSC組和高劑量BMMSC組皮膚存活時間分別為(5.13±1.37)、(6.15±1.29)、(9.29±1.14)、(9.41±1.71)d；中、高劑量BMMSC組皮膚存活時間較PBS組、低劑量BMMSC組長(P均<0.05)；PBS組與低劑量BMMSC組存活時間比較差異無統計學意義(P>0.05)，中、高劑量BMMSC組皮膚存活時間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組移植皮膚病理組織學變化 術后第7天，PBS組炎性細胞浸潤最明顯，隨著BMMSC劑量的增加，炎性細胞浸潤逐漸減少，高劑量BMMSC組炎性細胞浸潤最少。

2.3 各組脾臟組織IL-10、TNF-α、IFN-γ mRNA表達比較 術后第7天，與PBS組比較，低、中、高劑量BMMSC組脾臟組織IL-10 mRNA相對表達量比較差異無統計學意義(P均>0.05)，TNF-α、IFN-γ mRNA相對表達量低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組脾臟組織IL-10、TNF-α、IFN-γ mRNA相對表達量比較

2.4 各組血清IL-10、TNF-α、IFN-γ水平比較 與PBS組比較，中、高劑量BMMSC組血清IL-10水平高(P均<0.05)，低、中、高劑量BMMSC組血清TNF-α、IFN-γ水平低(P均<0.05)；與低劑量BMMSC組比較，中劑量BMMSC組血清TNF-α、IFN-γ水平低(P均<0.05)，高劑量BMMSC組血清IL-10水平高、TNF-α水平低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組血清IL-10、TNF-α、IFN-γ水平比較

3 討論

燒燙傷是日常生活中比較常見的意外傷害之一，據不完全統計我國每年有500萬～1 000萬人被不同程度的燒燙傷[5]，尤其是大面積、Ⅱ度、Ⅲ度及其他重度燒燙傷患者如果不能得到及時治療，病死率極高；而最常用的治療方法之一就是皮膚移植。對于大面積燒燙傷來說，自體皮膚移植很難實現，而異體或異種皮膚移植都不可避免出現嚴重的免疫排斥反應。因此降低甚至是消除移植后的免疫排斥反應是器官移植面臨的主要問題之一。目前研究最多的抑制移植免疫排斥的方法有：建立不同品系間嵌合體、阻斷第二信號等。建立不同品系間嵌合體常用射線照射或應用骨髓生長抑制劑的方法建立不同品系間骨髓嵌合體[6]；阻斷第二信號常通過結合抗原提成細胞CD80和CD86受體，從而阻斷T細胞活化的共刺激信號誘導免疫耐[7]。上述方法效果顯著，但有較高的危險性。間充質干細胞具有低免疫原性和抑制移植后的免疫排斥反應而備受關注，其主要來源有骨髓、脂肪、胎盤、臍血等，具有安全性高，取材來源廣泛等優勢。

研究表明，IL-10的主要生物學活性是免疫抑制作用，可通過抑制活化的T細胞分泌IL-12、TNF-α、IFN-γ，從而抑制遲發型變態反應[8]。陳富超等[9]發現，IL-10有抗家兔皮膚移植排斥反應的作用。Singla等[10，11]認為，免疫抑制劑主要通過調節調節性T細胞活性抑制IFN-γ、TNF-α等的分泌，從而抑制皮膚移植等免疫排斥反應[12，13]。TNF-α主要損傷內皮細胞，使移植皮膚因缺血而壞死[14，15]。因此，IL-10水平升高及IFN-γ、TNF-α水平降低均有助于降低免疫排斥反應，延長移植皮膚的存活時間。本研究通過建立不同品系間小鼠皮膚移植免疫排斥模型，探討BMMSC對移植皮膚存活時間的影響，并進一步探討其作用機制。當BMMSC通過尾靜脈注入受體小鼠體內后，通過血液循環迅速到達移植部位，調節免疫因子IL-10、TNF-α及IFN-γ等的表達，達到降低移植皮膚免疫排斥作用。結果，中、高劑量BMMSC組移植皮膚的存活時間明顯延長；低、中、高劑量BMMSC組TNF-α、IFN-γ 表達降低，中、高劑量BMMSC組IL-10 表達升高。進一步證明以上論點。

綜上所述，適當劑量的BMMSC通過尾靜脈注射至免疫排斥模型受體小鼠體內可明顯延長小鼠移植皮膚的存活時間，這可能與調節受體小鼠免疫因子IL-10、TNF-α及IFN-γ的表達有關。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.011

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楊宗軍(E-mail：a13789856688@126.com)

2017-07-05)