診斷試劑的研發

徐璐/中國獸醫藥品監察所OIE國家豬瘟參考實驗室

診斷試劑的研發

徐璐/中國獸醫藥品監察所OIE國家豬瘟參考實驗室

診斷試劑的研發過程，就是對所有可能影響檢測結果的因素進行不斷完善的方法確認過程。

一、方法的可行性

1.操作方法的確定。根據已有的材料和技術確定操作方法，并在現有的方法上進行改進。

2.對照樣本的選擇。陽性對照品選強、中、弱三種。

3.數據處理方法的確定。確定影響結果穩定性的因素；是否定量（包括相對定量和絕對定量）。

4.方法重復性的確定。方法是否穩定，是否具有不可控的影響因素；反應條件是否苛刻，能否通過規范化操作予以克服。

5.方法的優化。要考慮所有影響反應的因素，包括濃度、體積、時間、加樣順序等。

二、方法操作特性的確定

高傳染性、低致病性疾病通常將閾值設置的高一些，會提高其特異性，避免出現假陽性；高致病性疾病要降低臨界值，避免出現假陰性動物，此方法會降低疫病傳播的可能性，但也會造成特異性的降低。

陰陽性臨界值的確定：對已經確診的陽性和陰性進行檢測，以檢測結果的區段作為橫坐標，以相應的樣本數量為縱坐標，做曲線圖；陽性與陰性的曲線存在不同程度的重疊區域。

確定臨界值的有效工具——ROC曲線。ROC曲線指受試者工作特征曲線，以敏感性為縱坐標，1-特異性為橫坐標繪制成曲線，是反映敏感性和特異性連續變量的綜合指標，揭示敏感性和特異性的相互關系。（Youden指數=敏感性+特異性-1）

三、方法操作特性

1.敏感性。（1）分析敏感性：被分析物可檢出的最小劑量，即靈敏度，可用終點稀釋法進行確定；（2）診斷敏感性：檢測陽性樣本占真陽性樣本的比例；檢測結果為陰性的陽性樣本為假陽性。建議樣本量不應少于500～1000，并且應在目的群里隨機采樣。

如何篩選陽性樣本。采用統計學方法，對一群混合樣本（數千份）進行檢測，并將檢測結果進行統計學分析。如果檢測結果能夠明顯的分在兩個區域，即陽性與陰性分在不同的區域，則可以間接的說明該方法得到了臨床檢測樣本的預期結果。

2.特異性。（1）分析特異性：被分析物與其他物質的交叉反應程度；（2）診斷特異性：檢測陽性樣本占真陰性樣本的比例。檢測結果為陽性的陰性樣本為假陽性。建議的樣本量為1000～5000，并且應在目的群里隨機采樣。

3.重復性。是用本方法在正常和正確操作情況下，由同一操作人員，在同一實驗室內，使用同一儀器，并在短期內，對相同試樣所做多個單次測試結果，在95%概率水平兩個獨立測試結果的最大差值。

4.重現性。指在不同實驗室由不同分析人員測定結果之間的精密度。

5.符合率。待評價方法判定的結果與金標準方法的結果相同的數占檢測樣本總數的比例（金標準：指一種或一套用于準確確定感染和非感染的方法）。

6.一致性。待評價方法判定的結果與另一種診斷方法的結果相同的數占檢測樣本總數的比例。

四、在使用過程中對該方法使用效果的持續監測

1.保存期實驗。至少3批診斷制品的保存期實驗報告，包括各主要試劑的保存期實驗報告。

2.臨床實驗。臨床實驗中使用的制品應不少于3批，臨床樣品檢測數量不少于1 000份，犬貓等寵物樣品檢測數量不少于500份，臨床樣品中應包括陰性樣品，陽性、弱陽性樣品，其檢測結果需用其他方法確認。

五、保存期的確定

與原始的成品檢驗數據進行比較，保存期的定期=能夠達到質量標準的最長期限-3個月。對預期保存期不到12個月的獸用生物制品，在前3個月內應每個月進行一次檢測，以后每3個月檢測一次，對預期保存期超過12個月的，在保存期的前12個月內應每3年進行一次檢測，在第二年中每6個月進行一次檢測，以后每年進行一次檢測。

六、臨床實驗

1.獸醫診斷制品及注冊分類及注冊資料要求。（1）應不少于3批；（2）臨床樣品檢測數量不少于1000份，犬貓等寵物樣品檢測數量不少于500份；（3）臨床樣品中應包括陰性樣品，陽性、弱陽性樣品；（4）其檢測結果需用其他方法確認。

2.獸用診斷制品試驗研究指導原則。（1）必要時進行適應性試驗；（2）至少3批試劑盒；（3）至少3個可代表不同地理位置的實驗室。

六、試劑盒檢測結果統計

豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒對臨床樣本檢測結果的陽性率為80.96%，陰性率為85.90%；對比試劑盒檢測結果的陽性率為67.07%，陰性率為78.72%。以臨床樣本的免疫背景作為參考依據，豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒的敏感性和特異性均優于對比試劑盒。選用兩種ELISA抗體檢測試劑盒檢測結果不符合樣本282份，采用中和實驗方法進行驗證，比較中和實驗與兩種試劑盒的符合率，結果豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒與FVNT的符合率為69.26%，對比試劑盒與FVNT的符合率為28.62%。

七、診斷試劑盒的前景和發展方向

1.標記疫苗、基因工程疫苗、亞單位疫苗可作為鑒別診斷試劑。

2.隨著養殖規模的擴大，高度集成、自動化的儀器診斷是未來診斷的發展方向。

診斷試劑操作簡單、快速、便于普及，滿足了基層客戶的個性化需求。