蘋果輪紋病菌檢測方法及鑒定

摘要 選取蘋果輪紋病具有代表性的B. dothidea，成功地設計并且合成了B. dothidea實時熒光 PCR 引物和探針，建立了B. dothidea的實時熒光PCR檢測體系。結果表明，利用16S rDNA序列設計的特異性探針能夠快速檢測、鑒定植物病原B. dothidea，具有靈敏度高、不易污染和漏檢的優點。

關鍵詞 蘋果輪紋病菌；檢測方法；鑒定

中圖分類號 S436.611.1+6 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）19-0100-02

蘋果輪紋病是一種真菌性病害，病原菌為貝氏葡萄座腔菌梨專化型Botryosphaeria dothidea，可使蘋果果實腐爛、枝干樹皮疣突及局部壞死。蘋果輪紋病在我國發生范圍廣、危害重，在高溫多雨的地區發病尤為嚴重[1]，常年平均爛果率達20%～30%，多雨年份可達40%～50%，病果率非常高。一般在貯藏期發病，侵染后產生病斑，最后在病斑處形成顏色深淺不一、交替排列的同心輪紋，并在病健交界處有明顯間隔，因而得名輪紋病[2]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料。從南京口岸進境旅客攜帶物中截獲的可疑蘋果病果上分離所得菌株，包括炭疽病（Colletotrichum gloe-osporioides）、鏈格孢（Alternaria mali）、間座殼屬（Diaporth-aceae sp.）、擬莖點霉（Phomopsas mali）、可可色二孢（Lasiod-iplodia theobromae）、薔薇盾殼霉（Coniothyrium tirolensis）、奇異根串珠霉（Thielaviopsis paradoxa）、交鏈孢（Alternaria sp.）、美澳褐腐（Monilinia fructicola）、牛眼果腐（Neofabraea spp.），均由江蘇出入境檢驗檢疫局植檢所提供。

1.1.2 供試試劑。TIANGEN DP305DNA提取試劑盒。PDA培養基：馬鈴薯200 g，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，紗布過濾，再加20 g葡萄糖、20 g瓊脂，滅菌水1 000 mL。

1.1.3 供試儀器。實時熒光PCR儀ABIPRISM7500FAST PCR儀（ABI公司）和LightCycler1.5實時熒光定量PCR儀（ABI公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計。收集菌體供試菌株菌絲，用植物基因組 DNA提取試劑盒提取DNA。根據GenBank中蘋果輪紋病菌DNA中的保守序列設計1對寡核苷酸引物和TaqMan探針[3]。參照Wiiiam G 等設計16S rDNA通用引物對：

Bd-beta-FP GGCTCTGGCGTGTAAGTCTG

Bd-beta-RP GGTCCGAGGTGCCATTGTA

TaqMan探針Bd-beta-PFAM-TCTCAGCGTGGGAGAA-CATCAATGA-BHQ

1.2.2 實時熒光。實時熒光PCR檢測供試的炭疽病（Coll-etotrichum gloeosporioides）、鏈格孢（Alternaria mali）、間座殼屬（Diaporthaceae sp.）、擬莖點霉（Phomopsas mali）、可可色二孢（Lasiodiplodia theobromae）、薔薇盾殼霉（Coniothyrium tir-olensis）、奇異根串珠霉（Thielaviopsis paradoxa）、交鏈孢（Alt-ernaria sp.）、美澳褐腐（Monilinia fructicola）、牛眼果腐（Neo-fabraea ）菌株的DNA。

反應體系為20 μL，包括2×Premix Ex Taq10 μL、5 μmol/L上下游引物各0.8 μL、5 μmol/L探針0.2 μL、模板DNA 2 μL、50×ROX Reference DyeⅡ0.4 μL、加無菌水補至20 μL。反應程序為：95 ℃，10 min ；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，共40個循環。

將檢測樣品在ABIPRISM 7500 FAST上擴增，結束后打開分析軟件到找到Ct值，記錄下每個樣品的Ct值和Ct值分析檢測結果。

1.2.3 靈敏度檢測。將輪紋病菌菌液（B. dothidea）模板DNA逐級稀釋5倍，濃度分別為20.0、4.0、0.8 ng/L和150、50、10 pg/L（BECKMAN紫外分光光度測濃度）。退火溫度60 ℃，分別加入實時熒光體系中擴增。

2 結果與分析

2.1 特異性擴增

由圖1可知，該探針只對B. dothidea進行了特異性擴增，而對其他菌株沒有擴增[3]。

2.2 靈敏度試驗

由圖2可知，實時熒光PCR可以擴增不同濃度的B.dothidea模板DNA，并且濃度為10 pg/L時仍有擴增。雖然模板濃度與檢出率、特異性有一定的線性關系，但并非是成正相關，在模板濃度0.8 ng/L時擴增效率最高。模板濃度太高或太低都會使RCR反應受到干擾，影響擴增效率[3]。

通過已知起始拷貝數的標準品蘋果輪紋病（B. dothidea）RT-Realtime定量PCR做出標準曲線，log（起始濃度）與循環數呈線性關系，該擴增反應存在的線性關系（圖3）。

3 結論與討論

葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）下面有3個種，分別為B. dothidea、B. malicola和B. obtusa[4-5]。其中，B. dothidea是主要類群，B. malicola和B. obtusa為偶發類群[6]。致病性測定顯示B.obtusa也是蘋果果實輪紋病的一個新病原，但是在我國尚未發現蘋果黑腐病病菌B. obtusa侵染蘋果造成蘋果輪紋病的報道。本試驗的蘋果輪紋病選取了具有代表性的B. dothidea，成功地設計并且合成了B. dothidea實時熒光 PCR 引物和探針，建立了B. dothidea的實時熒光PCR檢測體系。試驗結果表明，利用16S rDNA序列設計的特異性探針能夠快速檢測、鑒定植物病原B. dothidea，靈敏度高、不易污染和漏檢[2-3]，可為快速檢測B. dothidea奠定基礎。

4 參考文獻

[1] 康玲，郝紅梅，楊振英，等.蘋果輪紋病研究進展[J].中國農學通報，2009（9）：188-191.

[2] 孫鑫垚.陜西省蘋果輪紋病病原菌鑒定與多樣性研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2010.

[3] 楊秋夏.入境旅客攜帶蘋果傳帶病原菌的風險分析及部分病原菌檢測技術研究[D].南京：南京農業大學，2014.

[4] 肖洲燁，李保華，國立耘.葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）的有性階段在我國蘋果主產區的發生[J].果樹學報，2013，30（6）：1005-1010.

[5] 趙增鋒，曹克強.蘋果輪紋病害流行研究及防控[J].北方園藝，2012（1）：127-129.

[6] 劉保友，王英姿，欒炳輝，等.蘋果輪紋病病原菌孢子田間釋放監測方法研究[J].中國果樹，2011（6）：48-50.endprint