超臨界流體CO2萃取浙貝母花生物堿的工藝研究

石一飛，陳巧青，徐永進(jìn)，李 思，汪財(cái)生，張慧恩

（浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波 315000）

超臨界流體CO2萃取浙貝母花生物堿的工藝研究

石一飛，陳巧青，徐永進(jìn)，李 思，汪財(cái)生，張慧恩

（浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波 315000）

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化，建立了浙貝母花生物堿超臨界萃取的工藝參數(shù)，確定了最佳萃取工藝條件。結(jié)果表明，生物堿超臨界萃取的最佳工藝條件為萃取溫度70 ℃，萃取壓力35 MPa，萃取時(shí)間50 min，夾帶劑流速0.15 mL/min，在此條件下總生物堿的理論提取率為3.52±0.15 mg/g。

貝母花；生物堿；超臨界萃取；正交試驗(yàn)

（College of Biological and Environmental Science， Zhejiang Wanli University， Ningbo， Zhejiang 315000， China）

浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.） 是多年生百合科貝母屬植物，主要分布在浙江、江蘇、安徽等地，是一種常用的藥用植物，《中國藥典》記載功能與主治為清熱化痰止咳、解毒散結(jié)消癰，用于風(fēng)熱咳嗽、痰火咳嗽、肺癰、乳癰、瘰疬、瘡毒等。其藥用部分主要是地下鱗莖[1-3]。目前，浙貝母的栽培地區(qū)主要在浙江鄞州，貝農(nóng)在種植過程中為了促進(jìn)地下鱗莖生長，通常在貝母花期將花和花蕾摘除，由于利用方式有限，大量浙貝母花被丟棄。而現(xiàn)在許多研究表明，浙貝母花中含有大量與地下鱗莖相似的有效成分，特別是鱗莖中的功效成分生物堿，在浙貝母花中也含量豐富。因此，浙貝母花是亟待開發(fā)利用的藥用資源。

超臨界萃取技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于中草藥及天然產(chǎn)物提取領(lǐng)域，通常以超臨界CO2為媒介。處于臨界狀態(tài)的CO2，具有液體和氣體的雙重優(yōu)點(diǎn)，既具有液體對物料的高滲透性和溶解能力，又具有氣體的高擴(kuò)散性和低黏度，而且在提取物中無溶劑殘留，有機(jī)溶劑使用量少。根據(jù)CO2分子的特性，其作為超臨界萃取溶劑極性小，依照“相似相溶”原理，特別適用于萃取小極性化合物。而在常規(guī)浙貝母生物堿的提取過程中，使用親脂性有機(jī)溶劑提取。目前，已有許多關(guān)于超臨界CO2應(yīng)用于中藥中生物堿的萃取[4-7]。因此，超臨界CO2非常適用于提取浙貝母生物堿。試驗(yàn)利用超臨界CO2萃取浙貝母花中的生物堿物質(zhì)，旨在為浙貝母花活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究和資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

浙貝母花，采自寧波市鄞江鎮(zhèn)，由浙江萬里學(xué)院周旭章鑒定，為浙貝母的花；浙貝甲素，阿拉丁試劑Lot#J1422097；甲醇、乙醇、氯仿、氫氧化鈉、二氧化碳，均為分析純；溴百里香酚藍(lán)（0.3 g溴百里香酚藍(lán)，溶于5 mL，1 mol/L NaOH溶液中加水稀釋至1 000 mL，定容后搖勻），pH值5.0的緩沖液（50 mL的0.2 mol/L鄰苯二甲酸氫鉀與23.66 mL的0.2 mol/L NaOH溶液混合，搖勻）。

SFE-2型超臨界CO2萃取儀，美國Applied Separations公司產(chǎn)品；M20 IKA-WERKE型精細(xì)研磨機(jī)；BSA124S型天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；UV-2400型紫外可見分光光度計(jì)；5810R型離心機(jī)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

將新鮮貝母花置于-80 ℃超低溫冰箱中，完全凍結(jié)后取出，置于冷凍干燥設(shè)備中，干燥條件為溫度-50 ℃，干燥時(shí)間48 h。將干燥的貝母花粉碎，過60目篩，待用。

取20.0 mg浙貝甲素放置在100 mL容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，得到0.2 mg/mL的對照品溶液。分別吸取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL，加入1 mL pH值5.0緩沖液和0.4 mL溴百里香酚藍(lán)顯色劑搖勻，再加氯仿定容至5 mL，取下層清液，在紫外可見分光光度計(jì)415 nm處，以氯仿作為空白對照，測吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：

Y=5.930 2X+0.025，R2=0.999 6.

準(zhǔn)確稱取2.0 g貝母花粉末，加入萃取釜中，通入CO2并設(shè)定萃取溫度。待萃取溫度穩(wěn)定后，通入夾帶劑并設(shè)定流速，將萃取壓力升高至試驗(yàn)設(shè)定值，開始靜態(tài)萃取。靜態(tài)萃取10 min后，開始動(dòng)態(tài)萃取，打開減壓閥，攜帶有萃取物的超臨界流體通過減壓閥后節(jié)流膨脹，釋放出萃取物后變?yōu)槌篊O2氣體，放空流速由浮子流量計(jì)測量，流速保持在5 L/min，萃取完畢后，將萃取物用甲醇溶解，定容至25 mL，測定浙貝甲素的質(zhì)量濃度，根據(jù)下式計(jì)算浙貝素甲提取率：

式中：C——浙貝甲素質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——萃取物定容后體積，mL；

m——貝母花質(zhì)量，g。

選擇影響貝母花生物堿提取率的4個(gè)因素及設(shè)置為萃取溫度（40，50，60，70，80 ℃）、萃取壓力（15， 20， 25， 30， 35 MPa）、 萃取時(shí)間 （10， 20，30， 40， 50 min）、 夾帶劑流速 （0.05， 0.10， 0.15，0.20，0.25 mL/min），在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行方差分析，優(yōu)化生物堿的超臨界萃取條件。

3 結(jié)果與討論

在萃取壓力25 MPa，萃取時(shí)間30 min，CO2流速保持在5 L/min的條件下，考查萃取溫度對生物堿提取率的影響。

萃取溫度對生物堿提取率的影響見圖1。

圖1 萃取溫度對生物堿提取率的影響

由圖1可知，當(dāng)萃取溫度在40～60 ℃時(shí)，生物堿提取率有顯著提高，并在60 ℃達(dá)到最高，繼續(xù)提高溫度，生物堿的提取率有明顯下降的趨勢。這可能是因?yàn)闇囟鹊脑黾邮笴O2的擴(kuò)散性增加，有利于生物堿的溶解；但另一方面溫度過高會(huì)使雜質(zhì)的溶出量增加，影響生物堿的溶出，提取率反而下降。故選擇萃取溫度為50～80 ℃。

在萃取溫度40 ℃，萃取時(shí)間30 min，CO2流速保持在5 L/min的條件下，考查萃取壓力對生物堿提取率的影響。

萃取壓力對生物堿提取率的影響見圖2。

圖2 萃取壓力對生物堿提取率的影響

由圖2可知，在25 MPa前隨著萃取壓力的升高，生物堿提取率有一定提高，之后緩慢下降。這可能是因?yàn)檩腿毫^高使物料之間的空隙過于緊密，不利于CO2的擴(kuò)散和傳質(zhì)，導(dǎo)致生物堿提取率下降。故選擇萃取壓力為20～35 MPa。

在萃取壓力25 MPa，萃取溫度40 ℃，CO2流速保持在5 L/min的條件下，考查萃取時(shí)間對生物堿提取率的影響。

萃取時(shí)間對生物堿提取率的影響見圖3。

由圖3可知，在30 min內(nèi)生物堿提取率隨萃取時(shí)間迅速提高，之后隨萃取時(shí)間的延長，提取率略有下降。這可能是因?yàn)樵趧?dòng)態(tài)萃取過程中，CO2在長時(shí)間的放空氣化時(shí)會(huì)帶走極少量的生物堿。綜合考慮，選擇萃取時(shí)間為20～50 min。

夾帶劑流速對生物堿提取率的影響見圖4。

圖3 萃取時(shí)間對生物堿提取率的影響

圖4 夾帶劑流速對生物堿提取率的影響

在貝母中存在的生物堿當(dāng)萃取溫度和萃取壓力及萃取時(shí)間不變的情況下，改變夾帶劑流速，夾帶劑流速在0.05～0.20 mL/min時(shí)，隨著夾帶劑流速的增加，總生物堿的提取率呈上升的趨勢；當(dāng)夾帶劑流速超過0.20 mL/min時(shí)，提取率基本不變。這可能是因?yàn)闃悠分械纳飰A都已被提取出來了。夾帶劑流速選擇在0.10～0.20 mL/min較為合適。

浙貝母花中總生物堿的提取正交試驗(yàn)選擇萃取壓力（A）、萃取時(shí)間（B）、萃取溫度（C）、夾帶劑流速（D） 4個(gè)因素為變量，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，采用四因素四水平的正交試驗(yàn)對工藝進(jìn)行優(yōu)化。

正交試驗(yàn)參數(shù)見表1，生物堿超臨界萃取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗(yàn)參數(shù)

由正交試驗(yàn)結(jié)果來看，各因素對試驗(yàn)結(jié)果的主次影響關(guān)系依次為萃取壓力＞萃取溫度＞萃取時(shí)間＞夾帶劑流速。其中，萃取壓力的F值大于F0.05，說明萃取壓力對試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響。以萃取壓力35 MPa，萃取溫度70 ℃，萃取時(shí)間50 min，夾帶劑流速0.15 mL/min為最佳組合。

取2.0 g貝母花，按照正交試驗(yàn)得到的最佳條件進(jìn)行萃取，3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，測得生物堿的提取率為3.52±0.15 mg/g。驗(yàn)證工藝數(shù)據(jù)與正交條件吻合，該工藝確實(shí)可行。

表2 生物堿超臨界萃取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

4 結(jié)論

目前，超臨界CO2萃取技術(shù)以其綠色、環(huán)保、高效等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于中藥材領(lǐng)域，是提取活性成分的重要手段。浙貝母花是中藥種植過程中的副產(chǎn)物，通過超臨界CO2萃取技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)資源的充分利用。運(yùn)用正交試驗(yàn)選擇最佳工藝條件，可以得到較為合理可靠的結(jié)果，可以大大減少試驗(yàn)次數(shù)，研究確定了超臨界CO2萃取最佳工藝為萃取壓力35 MPa，萃取溫度70 ℃，萃取時(shí)間50 min，夾帶劑流速0.15 mL/min，在此條件下生物堿的提取率為3.52±0.15 mg/g。

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TQ464.4

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.10.010

1671-9646（2017） 10a-0034-03

2017-09-18

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610876026）。

石一飛（1996— ），男，本科，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)工程。