雷公藤內酯酮抑制胃癌細胞惡性行為的作用與機理研究※

● 王振飛 賈永峰 牟永平 楊永燕 李景權

雷公藤內酯酮抑制胃癌細胞惡性行為的作用與機理研究※

● 王振飛1賈永峰1牟永平1楊永燕1李景權2▲

目的：觀察雷公藤內酯酮對人胃癌細胞惡性行為的抑制作用，并初步探討其作用機理。方法：CCK-8法檢測雷公藤內酯酮對BGC 823胃癌細胞增殖能力的影響，軟瓊脂集落形成法檢測雷公藤內酯酮對BGC 823細胞錨定非依賴性生長能力的影響，熒光定量PCR法檢測雷公藤內酯酮對BGC 823細胞中piRNA651表達的影響。結果：雷公藤內酯酮顯著地抑制了BGC 823細胞的增殖能力，IC50為165.17 nmol/L；當濃度等于或大于100 nmol/L時，雷公藤內酯酮有效地抑制了BGC 823細胞的錨定非依賴性生長能力；雷公藤內酯酮有力地下調了BGC 823細胞中piRNA651的表達。結論：雷公藤內酯酮可以降低胃癌細胞中促癌的非編碼RNA的表達，使其惡性行為受到顯著抑制，在胃癌的治療上具有良好的應用價值。

雷公藤內酯酮 胃癌 增殖 錨定非依賴性生長 piRNA

我國是胃癌的高發國家，每年新發病例占全球的50%[1]。很多胃癌患者早期無明顯癥狀，就診時已處于中晚期，治療以藥物為主。常規化療藥物效果有限，毒副作用巨大，復發轉移率高[2]。亟需開發出高效的、無毒的新型抗胃癌藥物，以貢獻于人類。

中國醫藥學博大精深，尤其在腫瘤治療方面，經過幾千年的臨床實踐，積累了豐富的經驗，很值得深入發掘，加以提高。雷公藤是一味傳統中藥，味苦，性涼，有活血通絡、破瘀鎮痛之功效[3]。雷公藤內酯酮是從雷公藤中分離出的一種環氧二萜內酯化合物。動物實驗表明，它在較高的劑量下對肝臟、腎臟等器官均無毒性作用[4]，也不會降低血液中紅細胞、白細胞的數量[5]，顯示出很高的安全性。以往對它的研究多集中于免疫抑制、抗炎和抗生育等方面[6，7]。對其抗腫瘤活性的報道甚少。本實驗中，我們首次觀察了雷公藤內酯酮對胃癌細胞增殖能力的影響，并從改變促癌的非編碼小RNA表達的角度探討了它的作用機理。

1 材料

1.1細胞株人胃癌細胞BGC 823購自中國科學院細胞庫。

1.2試劑雷公藤內酯酮由陜西辰光生物技術有限公司提供，批號：20151125，純度>98%，溶于二甲基亞砜(DMSO)，配成濃度為100mmol/L的貯存液。胎牛血清(10099133)、RPMI-1640培養液(11875093)、胰蛋白酶消化液(25200056)、DMSO(1572C502)均購自Gibco公司，CCK-8試劑盒(C16038)購自上海碧云天生物技術有限公司，低熔點瓊脂糖(358608)購自santacruze公司，小RNA提取試劑盒EasyPure miRNA Kit(J21204)、miRNA反轉錄和熒光定量PCR試劑盒TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix(AQ202-01)均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3儀器二氧化碳恒溫培養箱(Thermo)，超凈工作臺(蘇州金燕)，倒置相差顯微鏡(Nikon TE2000)，多功能酶標儀SpectraMax i3x(Molecular Devices)，7500 Real-Time PCR Systems(Applied Biosystem)。

2 方法

2.1胃癌細胞的培養人胃癌細胞BGC 823培養于含10%胎牛血清、0.1%雙抗的RPMI-1640培養基(完全RPMI-1640培養基)中，37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中常規培養，取對數生長期細胞進行實驗。

2.2 CCK-8法檢測細胞增殖能力將BGC 823細胞懸于完全RPMI-1640培養基中，調整濃度為2×104個/ml，接種于96孔板(0.2ml/孔)。培養24h后，藥物組加入雷公藤內酯酮(終濃度為50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、250nmol/L)，對照組加入DMSO。繼續培養48h，每孔加入CCK-8溶液20μl，培養箱內孵育1h。以450nm為檢測波長、以650nm為參考波長，測定吸光度。計算相對增殖率(藥物組吸光度/對照組吸光度)。

2.3軟瓊脂集落形成法檢測細胞錨定非依賴性生長能力向6孔板每孔中加入1ml含0.6%低熔點瓊脂糖的完全RPMI 1640培養液，搖勻后4℃靜置5min。將104個細胞懸于0.5ml含0.3%低熔點瓊脂糖的完全RPMI 1640培養液中，藥物組加入雷公藤內酯酮(終濃度分別為50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、250nmol/L)，對照組加入DMSO，覆于底層瓊脂糖之上。37℃、5%CO2培養3周，在顯微鏡下計大于100μm的集落數。

2.4熒光定量PCR法檢測piRNA651表達水平BGC 823細胞傳代培養24h后，藥物組加入雷公藤內酯酮(終濃度分別為50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、250nmol/L)，對照組加入DMSO，作用48h后，使用EasyPure miRNA Kit 試劑盒提取RNA，使用TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix 進行反轉錄和熒光定量PCR，操作按試劑盒說明書進行。熒光定量PCR條件為：94℃ 30s，(94℃ 5s，60℃ 34s)×40個循環。所用引物序列為：piRNA651上游引物5’-AGAGAGGGGCCCGTGCCTTG-3’，piRNA651下游引物Universal miRNA qPCR primer；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6下游引物Universal miRNA qPCR primer。以U6為內參，采用2-DDCt法計算piRNA651的相對表達量。

2.5統計分析使用SPSS17.0統計軟件對數據進行統計分析，計量資料用均數±標準差表示，采用單因素方差分析進行檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1雷公藤內酯酮抑制BGC 823細胞的增殖能力CCK-8 檢測結果顯示，雷公藤內酯酮對BGC 823 細胞的增殖能力具有顯著的抑制作用，并呈明顯的劑量依賴性，IC50為165.17nmol/L。見圖1。

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.2雷公藤內酯酮抑制BGC 823細胞的錨定非依賴性生長能力軟瓊脂集落形成實驗顯示，當濃度等于或大于100nmol/L時，雷公藤內酯酮對BGC 823細胞的錨定非依賴性生長能力具有顯著的抑制作用，尤其當濃度達到250nmol/L時，BGC 823細胞生長形成集落的能力完全喪失。見表1。

表1 雷公藤內酯酮對BGC 823細胞錨定非依賴性生長能力的影響

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.3雷公藤內酯酮抑制BGC 823細胞中piRNA651的表達熒光定量PCR結果顯示，雷公藤內酯酮對BGC 823細胞中piRNA651的表達具有顯著的抑制作用。見表2。

表2 雷公藤內酯酮對BGC 823細胞中piRNA651表達的影響

注：與對照組相比，**P<0.01。

4 討論

雷公藤為衛矛科雷公藤屬一年生藤本植物，在祖國醫學中有著悠久的藥用歷史，在臨床上對多種腫瘤都顯示了良好的治療效果。但其嚴重的的毒副作用，限制了它在臨床上的應用[8]。隨著現代生物技術的提高，從雷公藤中分離純化出了一系列單體，其中是否有抗腫瘤活性高、毒副作用低的單體，是一個值得深入研究的問題。已有的工作主要集中在雷公藤甲素和雷公藤紅素[9，10]這兩種物質上，發現它們雖有較好的抗腫瘤活性，但對肝臟、泌尿系統、生殖系統、消化系統、血液系統等會產生較大的毒性作用[11，12]。從雷公藤中分離出的雷公藤內酯酮，與雷公藤甲素和雷公藤紅素的分子結構不同，所產生的藥理作用也有差異。動物實驗表明：它對肝臟、腎臟和血液系統均無毒性作用[4，5]。對于雷公藤內酯酮是否具有抗胃癌活性，迄今尚未見報道。本研究首次選用雷公藤內酯酮作用于胃癌細胞，發現它可以有效抑制胃癌細胞的增殖能力和錨定非依賴性生長能力，可以有力抑制胃癌細胞中促癌的非編碼RNA的表達。這說明雷公藤內酯酮有望成為一種安全、高效的抗胃癌藥物。

非編碼RNA表達的異常是胃癌發生發展的一個重要原因。piRNA是近年新發現的一類非編碼RNA，長度25-36個核苷酸，它們在調控轉座因子活動、染色質完整性、DNA甲基化、mRNA穩定性等多個過程中發揮重要作用[13]。在肝癌[14]、胃癌[15]和乳腺癌[16]中，已發現一些piRNA的表達異常升高，使得抑癌基因啟動子區發生超甲基化而引起轉錄失活，使得癌基因mRNA的降解受到抑制而增強其翻譯活動，從而有力地促進了腫瘤的發生發展。已有研究證實：piRNA651在胃癌組織中處于高表達狀態，極大地促進了胃癌細胞的增殖活動[15]。本研究發現，雷公藤內酯酮可以下調胃癌細胞中piRNA651的表達，這為闡明雷公藤的抗癌機理提供了一條新途徑。

很多有抗腫瘤活性的中藥，都有一定的毒副作用，使其在臨床上的應用受到限制。但是，每味中藥都是一個天然的化合物庫，其中含有很多種活性物質，每種活性物質的毒性和藥理作用是各不相同的，對它們進行細致的篩選，并加以針對性的研究，是可以尋找到低毒、甚至無毒，同時又有較好抗腫瘤活性的物質的，進而開發出屬于我們中華民族自己的、具有獨特療效的抗腫瘤新藥，造福于人類。

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國家自然科學基金(No.81760552)；內蒙古自然科學基金(No.2016MS0824)；內蒙古自治區高等學校創新團隊發展計劃(No.NMGIRT-A1604)

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李景權，男，助理研究員。主要研究方向：藥學。E-mail：wzfsub12@126.com

1.內蒙古醫科大學(010020)；2.巴彥淖爾市食品藥品檢驗所(015000)