玫瑰香干紅葡萄酒自然發酵過程中優勢酵母分離鑒定及其應用潛力分析

閻賀靜，時 月，劉 暢，趙琳琳

（1.河北科技師范學院食品科技學院，河北 昌黎 066600；2.國家糧食儲備局武漢科學研究設計院，湖北 武漢 430079）

玫瑰香干紅葡萄酒自然發酵過程中優勢酵母分離鑒定及其應用潛力分析

閻賀靜1，時 月1，劉 暢1，趙琳琳2

（1.河北科技師范學院食品科技學院，河北 昌黎 066600；2.國家糧食儲備局武漢科學研究設計院，湖北 武漢 430079）

為釀造特色玫瑰香干紅葡萄酒，開發本土發酵劑是目前重要發展方向。從昌黎產區玫瑰香干紅葡萄酒自然發酵醪中共分離得到337 株酵母，通過WL（Wallerstein laboratory）鑒別培養基對其進行分類鑒定、計數，將其鑒別為7 大類，根據計數結果選取優勢酵母接種至BIGGY（bismuth sulphite glucose glycine yeast）固體培養基，從中進一步篩選不產H2S酵母，進行分子鑒定，結果顯示HBKS-Y1、HBKS-Y3為釀酒酵母，HBKS-Y 2為葡萄汁有孢漢遜酵母?？疾? 株本土酵母釀造因子耐性，發現3 株酵母對乙醇、SO2、糖度均具有較高耐性，滿足葡萄酒釀造要求；以商用活性干酵母FX10葡萄汁發酵為對照，考察3 株酵母對玫瑰香葡萄汁單菌、混菌發酵理化指標和香氣成分的影響，3 株本土酵母單菌和混菌發酵各指標（例如：還原糖、酒精度、總酸、揮發酸、甘油和乙醛含量）均符合干紅葡萄酒釀造標準。同時發現，與HBKS-Y2單菌發酵相比，3 株酵母混菌發酵總酸和揮發酸含量降低，對葡萄酒有益，且混菌發酵對葡萄酒其他理化指標沒有不利影響。本土酵母發酵尤其是混菌發酵，表征玫瑰香品種香氣的萜烯醇類物質含量明顯高于活性干酵母發酵。以上結果表明，3 株本土酵母可以應用于玫瑰香干紅葡萄酒的釀造，且3 株酵母混菌發酵對突出玫瑰香干紅葡萄酒品種香氣具有一定的應用潛力。

玫瑰香干紅葡萄酒；本土酵母；分離；鑒定；釀造特性；混菌發酵

目前，與法國、意大利等葡萄酒產業發展歷史悠久的國家相比，我國在葡萄酒酵母篩選鑒定及自主復合發酵劑研制等應用基礎方面的研究相對薄弱，這使得我國目前生產葡萄酒所用的菌種主要依賴進口，導致葡萄酒同質化問題嚴重，這一直成為制約我國特色葡萄酒產業發展的關鍵問題。因此，大力發掘我國本土寶貴的酵母資源，是解決這一瓶頸的關鍵所在。昌黎是我國歷史悠久的葡萄與葡萄酒產區，玫瑰香是昌黎產區重要的鮮食和釀酒兩用葡萄品種。由玫瑰香釀造的玫瑰型葡萄酒口味清爽優雅，具有迷人的玫瑰香氣，果味突出，具有明顯的品種特征，受到廣大消費者的喜愛。但是，近些年來由于缺乏產區釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），玫瑰香干紅葡萄酒的釀造多采用進口活性干酵母進行，導致玫瑰香干紅葡萄酒風格單一，品種特色不突出。為了開發地域特色明顯、品種特色突出的玫瑰香干紅葡萄酒，篩選具有優良釀造特性的本土酵母是開發特色玫瑰香干紅葡萄酒的重要途徑。

葡萄酒釀造是一個由多種微生物參與的復雜生物化學過程，其中酵母菌的種類和含量對葡萄酒的風味特征有重要影響。我國葡萄種植面積廣，各葡萄產區生態條件差異大，可生產不同種類和風味的釀酒葡萄。但我國有關葡萄酒酵母的研究和利用相對滯后，葡萄酒的釀造多依賴進口活性干酵母?；钚愿山湍鸽m發酵速率高、產品質量穩定，但容易造成葡萄酒口味趨同，導致我國葡萄酒同質化嚴重，地域和品種特色不突出[1]。傳統的葡萄和葡萄酒產區，經過長時間的優勝略汰，含有大量適合本地氣候、環境特點的本土酵母，結合葡萄品種特點，很易釀造出具有地域和品種特色的葡萄酒[2-3]。隨著對本土酵母研究的深入，越來越多的研究證明了本土酵母在釀造地域和品種特色葡萄酒中的應用潛力[2,4]。因此，近些年來采用本土酵母作為發酵劑成為特色葡萄酒釀造新的發展方向和研究熱點[5-6]。人們過去認為非釀酒酵母（non-Saccharomyces，NSC）會對葡萄酒的釀造帶來不利影響，隨著對NSC研究的深入，發現這種認識并不全面。近年來的許多研究發現，NSC對葡萄酒的風味和感官具有積極作用[7-9]。同時，NSC與S. cerevisiae混菌發酵還可以調節葡萄酒的風味[4-5,10]。例如：Metschnikowia pulcherrima和S. cerevisiae共同進行酒精發酵時具有明顯的協同作用，促進了脂肪酸、酯和萜烯等多種芳香物質的形成[11]；將Torulaspora delbrueckii與S. cerevisiae同時或依次接入葡萄醪中進行酒精發酵，提高了葡萄酒中酒精和具果香的酯類物質的含量，降低了乙酸的含量[11]，這充分顯示了混菌進行酒精發酵的優勢。因此，許多學者建議在S. cerevisiae進行酒精發酵的同時，添加NSC進行混菌發酵，這樣既避免了葡萄酒酸敗的風險，同時又保留了自然發酵的優勢[12]。因此，展開本土酵母資源的研究，開發S. cerevisiae和NSC混菌發酵劑是釀造特色葡萄酒的重要途徑。目前，我國學者正開展大量研究挖掘本土酵母資源，對我國葡萄酒釀造酵母資源的多樣性有了更深一步的了解[4,13-16]。但對這些酵母資源的開發與利用的研究還處于起步階段，有關本土酵母的釀造特性和應用潛力的相關研究還較少。目前，國內已有研究者對昌黎產區本土酵母資源的多樣性開展了研究[17-19]，但對昌黎本土酵母資源的研究深度、開發和應用還遠遠不夠，更鮮有從中分離適合玫瑰香干紅葡萄酒釀造的本土酵母的相關研究報道。

本實驗從玫瑰香干紅葡萄酒自然發酵醪中分離純化優勢酵母，對玫瑰香葡萄汁進行單菌和混菌發酵，探討所選本土酵母在玫瑰香干紅葡萄酒釀造中的應用潛力，為特色玫瑰香干紅葡萄酒釀造用優良酵母及混合發酵劑的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰香葡萄（Vitis vinifera L. cv. Muscat Hamburg），2014年10月份購自河北省秦皇島市昌黎縣葡萄溝。

商用活性干酵母FX10 法國Laffort公司；甘油和乙醛含量測定試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司。

1.2 儀器與設備

7890B-5977氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰香葡萄自然發酵醪中酵母菌的分離、篩選和初步分類鑒定

玫瑰香葡萄除梗、破碎置于無菌容器，于室溫進行自然發酵。分別于發酵前、中、后期取樣，樣品梯度稀釋后涂布于酵母浸出物葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基，28 ℃培養2～3 d，從適宜稀釋度平皿中挑取全部酵母菌落并進行計數、保藏。將保藏的酵母分別點種于WL（Wallerstein laboratory）鑒別培養基，于28 ℃培養5～7 d，觀察記錄菌落特征，對不同形態特征酵母進行分類、計數[20]。根據計數結果，選取其中優勢酵母點種于BIGGY（bismuth sulphite glucose glycine yeast）固體培養基，28 ℃培養4～7 d，每天觀察菌落顏色變化，根據顏色深淺判斷菌株H2S產生能力，從中分離不產H2S酵母并保藏。判斷標準：認為顏色依次從白色、奶油色、淺棕色、棕色、深棕色、黑色為由淺變深，顏色越深表明H2S產生能力越強[21]。

1.3.2 玫瑰香葡萄自然發酵醪中優勢酵母的分子鑒定

將保藏菌種接種于斜面PDA培養基，培養2～3 d后挑取菌體至50 μL TaKara裂解緩沖液（Code No.9164），80 ℃變性15 m in，離心，取上清液為模板，選用TaKara試劑盒（Code No.RR178）對酵母26S rDNA擴增并測序。使用Takara試劑盒（Code No.9762）切膠回收目的片段，以Seq Forward為引物進行DNA測序，測序結果在NCBI數據庫進行比對。

1.3.3 本土酵母生長曲線測定

將酵母菌接種于100 m L豆芽汁液體培養基，于28 ℃、180 r/m in搖床培養18 h，備用。將50 m L豆芽汁培養基分裝至100 m L三角瓶中高壓滅菌，接入2 m L測試菌液，28 ℃、180 r/m in恒溫培養。以未接種培養基為空白，從0 h開始每4 h取樣至穩定期，測樣品600 nm波長處吸光度并繪制生長曲線。所有實驗均設置3 個平行。

1.3.4 本土酵母釀造因子耐性分析

分別將10 μL測試菌接種至不同乙醇體積分數（10%、12%、14%和16%），不同SO2質量濃度（200、250 mg/L和300 mg/L），不同葡萄糖質量濃度（100、200、300、400、500 g/L和600 g/L）的YPD培養基中，28 ℃培養72 h，觀察菌株生長情況，判斷酵母對乙醇、SO2和糖的耐受性。所有實驗均設置3 個平行。

1.3.5 葡萄汁發酵實驗及理化指標測定

調整玫瑰香葡萄汁糖度為21%（質量分數），將活性干酵母FX 10、本土酵母單菌或3 株菌共同接種至滅菌葡萄汁，接種量為106個/m L，20 ℃條件下進行發酵。每隔24 h取樣測理化指標，發酵液比重低于0.993時終止發酵。依據GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定發酵液中還原糖、酒度、總酸、揮發酸含量，發酵液中甘油和乙醛含量均采用試劑盒測定。所有實驗均設置3 個平行。

1.3.6 葡萄酒香氣成分測定

葡萄汁發酵結束后取樣，10 000 r/m in離心15 m in，取上清液冷凍貯藏備用。取5 m L酒樣加入頂空瓶，同時加入1 g NaCl和10 μL 2-辛醇（內標），加蓋密封，40 ℃恒溫攪拌30 m in，將固相微萃取頭插入頂空瓶靜態吸附30 m in，將萃取頭插入氣相色譜進樣口，250 ℃熱解吸5 m in。氣相色譜分離條件：HP-5ms石英彈性毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣He（99.99%），流速1.0 m L/m in，不分流；升溫程序：起始溫度為50 ℃，保持1 m in，以3 ℃/m in升至230 ℃，保持10 m in，再以5 ℃/m in升至250 ℃，保持3 min。質譜檢測條件：電子電離源溫度230 ℃，電壓70 eV，接口溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，質量掃描范圍m/z 33～450。

1.4 數據處理

數據采用Excel 2007進行計算。本實驗中檢測結果用SPSS 19軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 玫瑰香干紅葡萄酒自然發酵醪中酵母菌的分離鑒定

通過平板分離，從玫瑰香干紅葡萄酒自然發醪中共分離得到337 株本土酵母。根據菌落在WL培養基中的不同形態和顏色特征，將其初步鑒定為7 大類：S. cerevisiae（2 種）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hansen iaspora uvarum）、膜畢赤氏酵母、假絲酵母和粟酒裂殖酵母，其中一種酵母菌落形態特征文獻中未提及，暫時未能鑒定。過量的H2S會使葡萄酒呈現臭雞蛋味，因此葡萄酒釀造酵母的篩選應避免選用產H2S的酵母。根據WL培養基計數結果，將其中3種優勢酵母分別點種于BIGGY固體培養基，根據菌落顏色的深淺篩選出3 株不產H2S酵母菌株，分別編號為HBKS-Y 1、HBKS-Y 2、HBKS-Y 3。對3 株酵母菌26S rDNA D1/D2區序列進行聚合酶鏈式反應擴增測序，并在NCBI數據庫中進行比對（基因庫接受號分別為LC002242.1、HM 627056.2和KM 055472.1），結果HBKS-Y1和HBKS-Y3被鑒定為S. cerevisiae，HBKS-Y2被鑒定為H. uvarum，此結果與WL培養基初步鑒定結果一致。

2.2 本土酵母HBKS-Y1、HBKS-Y2和HBKS-Y3的釀造特性

2.2.1 本土酵母HBKS-Y1、HBKS-Y2和HBKS-Y 3的生長曲線

生長曲線測定結果表明，3 株本土酵母菌生長趨勢基本一致，都具有顯著的延滯期、對數生長期、穩定期，沒有衰亡期（圖1），這與文獻有關酵母生長曲線的報道一致[10]。HBKS-Y1、HBKS-Y3和HBKS-Y2的對數生長期分別出現在發酵的8～24 h和4～16 h。表明HBKS-Y2進入對數生長期較早，但持續時間較HBKS-Y 1、HBKS-Y 3短，同時HBKS-Y 2菌體數量較HBKS-Y 1和HBKS-Y3低，這一研究結果與Moreira等[11]關于H. uvarum的研究結果一致。

圖1 3 株本土酵母生長曲線Fig. 1 Grow th curve of the indigenous yeasts

2.2.2 本土酵母HBKS-Y1、HBKS-Y2和HBKS-Y 3的釀造因子耐性分析

表1 3 株本土酵母釀造因子耐受性Table 1 Tolerance of the indigenous yeast strains

表1數據表明，HBKS-Y 1、HBKS-Y2和HBKS-Y3可分別耐受16%、14%和16%的乙醇溶液，均對酒精具有一定的耐受性，能滿足葡萄酒正常發酵需求。在SO2質量濃度為200～300 mg/L時3 株菌均能生長，說明3 株酵母對SO2均具有一定的耐受性，能夠在葡萄酒釀造SO2范圍內正常發酵。3 株本土酵母均能耐受500 g/L以下的葡萄糖質量濃度，但不能耐受600 g/L的糖質量濃度。

2.2.3 本土酵母HBKS-Y1、HBKS-Y 2和HBKS-Y3發酵實驗

HBKS-Y1、HBKS-Y2和HBKS-Y3單菌及3 株酵母混菌發酵均能在11 d內完成（圖2）。發酵結束后，活性干酵母發酵殘糖量最低，發酵最徹底（表2）。據報道，酒精發酵結束時殘糖量若大于4 g/L則表明發酵不徹底，有酸敗的危險[22]。HBKS-Y2單菌發酵速度相對較慢，殘糖量高于4 g/L，有酸敗危險；但與HBKS-Y 1、HBKS-Y 3混菌發酵后，發酵速度有所提升，殘糖量降低（圖2和表2），說明HBKS-Y 2不會延緩混菌發酵。發酵結束后，活性干酵母發酵酒度（乙醇體積分數）最高（12.869%），HBKS-Y 2產乙醇能力介于HBKS-Y 1和HBKS-Y3之間，混菌發酵對3 株菌產乙醇能力稍有影響。

圖2 本土酵母發酵過程中還原糖含量Fig. 2 Change in reducing sugar content during w ine fermentation

表2 本土酵母葡萄汁發酵實驗結果Tab le 2 Physicochem ical properties of w ines fermented w ith the indigenous yeast strains

HBKS-Y2單菌發酵總酸質量濃度最高（4.273 g/L），活性干酵母發酵最低（4.003 g/L），混菌發酵對HBKS-Y 2產酸有抑制作用，有利于總酸含量的降低。GB 15037—2006《葡萄酒》中規定葡萄酒中總酸與總糖含量的差值不大于2.000 g/L即可，本實驗所有發酵結果均符合此要求。各發酵形式揮發酸含量均保持在較低水平（表2），符合葡萄酒釀造國標要求，HBKS-Y2單菌發酵揮發酸質量濃度最高（0.271 g/L），混菌發酵可顯著降低葡萄酒中揮發酸含量。混菌發酵乙醛含量最低，甘油含量僅次于活性干酵母發酵（表2），表明混菌發酵對乙醛和甘油的影響有益于葡萄酒感官和風味。

2.3 本土酵母HBKS-Y1、HBKS-Y2和HBKS-Y3發酵酒樣香氣成分

不同酵母對玫瑰香葡萄汁進行發酵，氣相色譜-質譜檢測和分析酒樣香氣成分。HBKS-Y 3單菌發酵香氣成分種類最多（49 種），活性干酵母發酵次之（42 種），3 株本土酵母混菌發酵香氣成分種類最少（28 種）。

酯類物質是葡萄酒最重要的香氣成分，表3分別列出了不同發酵主要酯類物質及其含量。其中活性干酵母發酵酯類物質總量最高（168.500 mg/L），混菌發酵最低（43.641 mg/L），遠低于各酵母單菌發酵，表明混菌發酵抑制了各酵母的產酯能力，這一點與文獻報道H. uvarum可以增加葡萄酒中酯類物質含量的報道并不一致[5]。乙酸乙酯是葡萄酒中最重要和最常見的酯類物質，乙酸乙酯含量過高會使葡萄酒帶有強烈的醋酸味，對葡萄酒風味不利。HBKS-Y 2發酵乙酸乙酯質量濃度最高（111.028 mg/L），遠高于其他發酵形式，混菌發酵含量僅為HBKS-Y 2單菌發酵時的9.46%。表明混菌發酵抑制乙酸乙酯的形成，對葡萄酒的風味產生有益影響。

高級醇為葡萄酒重要香氣成分，含量適當時賦予葡萄酒復雜感。表3列出了不同發酵產生的主要高級醇及其含量。HBKS-Y3發酵高級醇總量最高（379.12 mg/L），活性干酵母發酵次之（378.792 mg/L），HBKS-Y2發酵最低（248.33 mg/L）?；炀l酵高級醇總量為276.74 mg/L，遠低于S. cerev isia e發酵，表明混菌發酵抑制了S. cerevisiae（HBKS-Y1和HBKS-Y3）高級醇的產生。

表3 不同本土酵母發酵葡萄酒樣中主要香氣成分含量Table 3 Aroma compounds identified in Muscat wines from different yeast fermentations

萜烯醇類物質是玫瑰香葡萄重要的品種香氣。由表4可見，雖然活性干酵母發酵檢測出的萜烯醇種類最多（6種），HBKS-Y1單菌發酵檢測出的種類最少（4種），但混菌發酵萜烯醇類物質總量最高（416.525 μg/L），活性干酵母發酵總量最低（293.686 μg/L）。由此可見，本土酵母發酵尤其是混菌發酵最有利于提高葡萄酒中萜烯醇類物質的含量。

表4 不同本土酵母發酵葡萄酒樣中萜類物質含量Tab le 4 Terpene concentrations in M uscat w ines from different indigenous yeasts fermentation

3 討 論

3.1 NSC對葡萄酒釀造的影響

本實驗從玫瑰香干紅葡萄酒自然發酵醪中分離出2 株S. cerevisiae和1 株H. uvarum，為玫瑰香干紅葡萄酒自然發酵過程中的優勢酵母。參與葡萄酒釀造的酵母主要有兩大類：S. cerevisiae和NSC。在葡萄酒釀造過程中，S. cerevisiae將糖轉化為乙醇和CO2，是葡萄酒釀造的主要完成者。通常認為，發酵初期NSC占主導地位，隨著發酵的進行S. cerevisiae迅速替代NSC直至酒精發酵結束[12]。過去認為，NSC通常會產生較高含量的揮發酸、乙醛等不良風味物質，同時還會引起葡萄酒的酸敗，對葡萄酒釀造不利[23-24]。所以，現代化的葡萄酒釀造只使用單一活性干酵母作為葡萄酒發酵劑。隨著對NSC研究的深入，發現許多NSC對葡萄酒的風味和感官具有積極作用[25-27]。因此，越來越多的研究關注NSC在葡萄酒釀造過程中的作用。

H. uvarum是葡萄酒自然發酵醪中最常見的NSC，同時也是各葡萄酒產區含量較高的NSC之一[4,16]。傳統觀點認為H. uvarum發酵效率低、發酵不徹底、不耐酒精，且生成較多的醋酸，是對葡萄酒質量不利的菌種[23]。有研究報道，尖端酵母（H. uvarum屬于尖端酵母）與S. cerevisiae混菌發酵，會對S. cerevisiae生長繁殖不利，從而導致發酵延滯甚至酸敗[23,28]。但有研究發現，H. uvarum與S. cerevisiae混菌發酵可以增加葡萄酒的香氣復雜性，有利于葡萄酒的質量提高[5]。近些年來，由于較高的產酯能力及其對葡萄酒風味和質量的有利作用，H. uvarum越來越受研究者的關注[5,23]。

為篩選適合玫瑰香干紅葡萄酒釀造發酵劑，本研究重點考察3 株酵母的葡萄酒釀造特性，并以商用活性干酵母FX10發酵為對照，初步探討3 株本土酵母混菌發酵應用于玫瑰香干紅葡萄酒釀造的可能性，及其對于突出玫瑰香干紅葡萄酒品種香氣的應用潛力。

3.2 本土酵母對葡萄酒釀造因子耐受性分析

在葡萄酒的釀造中，酵母酒精耐受性低可能會導致發酵緩慢甚至中止，因此具有較高酒精耐性是保證發酵順利進行的前提條件。本研究考察的3 株酵母均對酒精具有一定的耐受性，可以滿足葡萄酒的正常發酵需求。但S. cerevisiae HBKS-Y 1和HBKS-Y 3對乙醇耐受性高于HBKS-Y2，這一結果與一些文獻中關于H. uvarum酒精耐受性低的報道一致[11,23]。在葡萄酒生產過程中，加入適量的SO2可以抑制有害微生物，同時可達到抗氧化、護色等作用。優良葡萄酒酵母需對SO2具有一定的耐受性。本實驗獲得的3 株菌對SO2具有一定的耐受性，能夠在葡萄酒釀造SO2范圍內正常發酵。葡萄自然發酵過程中存在的一些NSC，本身發酵能力差、不能單獨完成酒精發酵，同時對乙醇、SO2的耐性低，這是導致NSC在酒精發酵過程中數量降低甚至消失的原因之一。但也有些研究提出酒精發酵時NSC的衰亡是S. cerevisiae本身引起的，而不是乙醇的作用[29-30]；尤其是現在還分離到一些NSC，它們對酒精耐性遠大于曾經報道的數據，更說明酒精并不是引起NSC衰亡的關鍵因素[31]。本實驗所篩選到的HBKS-Y2，是玫瑰香干紅葡萄酒自然發酵過程中的優勢酵母，WL培養基計數結果表明，該菌存在于自然界過程中的各個時期，說明HBKS-Y 2對葡萄酒釀造因子具有一定的耐性，具有一定的應用潛力。

3.3 本土酵母混菌發酵對葡萄酒理化指標的影響

目前的一些研究發現，混菌發酵過程中酵母間會產生不利影響，例如：某些NSC分泌的中長鏈脂肪酸對S. cerev isiae有抑制作用[24]。同時，有研究表明S. cerevisiae代謝產物中某些蛋白或抗菌肽AMP可能是混菌發酵過程中導致NSC提前衰亡的主要原因[31-34]。以上研究說明，順利完成混菌發酵并非易事，需對酵母間的交互作用進行有效控制。但需要確定混菌發酵過程中S. cerevisiae和NSC的交互作用機理，但目前尚無明確的研究結果。

本實驗中3 株優勢酵母單菌和混菌發酵結果發現，HBKS-Y 2與HBKS-Y 1、HBKS-Y 3混菌發酵相互之間沒有不利影響，發酵液中酒精度、殘糖量、總酸和揮發酸含量均在干紅葡萄酒正常發酵范圍之內（表2），表明3 株本土酵母單菌或混菌均能順利完成酒精發酵。雖然HBKS-Y 2單菌發酵揮發酸含量較高，但與HBKS-Y 1、HBKS-Y 3混菌發酵后揮發酸總量降低顯著，低于各單菌發酵?？梢? 株本土酵母混菌發酵抑制了HBKS-Y2揮發酸物質的合成，對葡萄酒的風味起積極作用，這一結果與文獻報道的混菌發酵過程中，H. uvarum不會引起揮發酸含量增高的結果一致[5,27]。作者分析認為，3 株菌來自于昌黎玫瑰香干紅葡萄酒自然發酵醪，是經過長期優勝劣汰存活、適應相應環境的優勢酵母，相互之間具有一定的適應性，這對釀造地域特色葡萄酒是非常有利的，是開發特色葡萄酒釀造發酵劑的優良資源。以上分析表明，從昌黎產區玫瑰香干紅葡萄酒自然發酵醪中分離獲得的葡H. uvarum具有優良的釀造特性，可與本土S. cerevisiae進行混菌發酵。

3.4 本土酵母混菌發酵對葡萄酒香氣的影響

香氣是葡萄酒產品風格和特征差異的重要方面。參與酒精發酵的酵母菌種類和數量對葡萄酒的香氣最為重要。不同酵母的生理活性及代謝過程不同，對風味物質的影響不同。HBKS-Y1和HBKS-Y3單菌發酵酒樣香氣成分種類遠多于HBKS-Y2單菌和混菌發酵，說明混菌發酵中3 株酵母間產生了交互作用，影響了某些香氣成分的合成，這一研究結果與文獻報道混菌發酵可增加葡萄酒風味的復雜性并不太一致[27,32]，具體原因需進一步研究。

乙酸乙酯是葡萄酒中主要酯類物質，質量濃度為150～200 mg/L時會給葡萄酒帶來強烈的醋酸味[30]。尖端酵母，尤其是K. apiculata發酵會產生較高含量的乙酸和乙酸乙酯已被廣泛報道[5,35-37]。這是之所以一些研究者盡量避免使用尖端酵母作為葡萄酒發酵劑的主要原因之一。表3的數據表明，與HBKS-YI、HBKS-Y 3單菌發酵相比，HBKS-Y2單菌發酵確實產生了大量的乙酸乙酯，但與HBKS-Y1和HBKS-Y3混菌發酵后，乙酸乙酯含量顯著降低，說明3 株本土酵母混菌發酵抑制了HBKS-Y 2乙酸乙酯的生成，對葡萄酒香氣產生有益作用。

文獻報道，葡萄酒中高級醇總量低于300 m g/L時賦予葡萄酒愉悅的香氣，當其總量高于400 m g/L時對葡萄酒香氣產生不利影響[38]。經檢測，活性干酵母、HBKS-Y 1、HBKS-Y 3單菌發酵高級醇總量遠高于HBKS-Y 2單菌發酵，3 株酵母混菌發酵后高級醇含量雖高于HBKS-Y 2單菌發酵，但是卻遠低于HBKS-Y 1、HBKS-Y 3和活性干酵母發酵，表明混菌發酵過程中，HBKS-Y 2的存在與S. cerevisiae產生了交互作用，抑制了高級醇生產，對于控制酒樣中高級醇的含量產生了積極作用。此結果與M o reira等[11]報道的尖端酵母（H. guilliermondii和H. uvarum）與S. cerevisiae混菌發酵可以降低葡萄酒中高級醇含量的研究結果一致。

葡萄酒香氣成分中，萜烯類物質含量雖低，但其嗅覺閾值低，氣味活性很高，且呈香具疊加效應，因此萜烯類物質是葡萄酒中重要的呈香成分[39]。玫瑰香葡萄是玫瑰香型葡萄的代表品種，萜烯類物質是玫瑰香葡萄的主要品種香氣物質，其中橙花醇、香葉醇、里哪醇、香茅醇、松油醇等萜烯醇是最主要的萜烯物質，該類物質含量越高葡萄酒的品種香氣越突出。表4的數據表明，活性干酵母發酵萜烯醇類物質種類最多，但本土酵母混菌發酵酒樣中萜烯醇總量卻最高，HBKS-Y1和HBKS-Y2單菌發酵酒樣中萜烯醇物質總量次之，而商用活性干酵母發酵萜烯醇含量最低。由此可見，酒精發酵選用菌種對葡萄品種香氣的含量具有重要影響。以上分析表明，本土酵母尤其是混菌發酵有利于增加葡萄酒中萜烯醇類物質的含量，從而更有利于突出玫瑰香干紅葡萄酒的品種香氣。傳統的葡萄和葡萄酒產區的本土酵母，經過長時間的優勝劣汰，適應了本土氣候和環境，許多研究證明本土酵母更加有益于釀造品種特色突出的葡萄酒[2-3]。本研究結果也進一步驗證了這一點。

此外，葡萄中的萜類物質以糖苷結合態形式存在，不具揮發性，不能呈現香氣。釀酒過程中，S. cerevisiae和葡萄漿果內源糖苷酶可以催化部分結合態萜類物質，但葡萄酒高糖量、高酒精、低pH值等釀造條件，限制了內源糖苷酶的活性[40]，葡萄酒釀造過程中結合態萜類物質的水解并不充分。新發酵生成的葡萄新酒中還存在大量的結合態香氣糖苷。因此，在釀造過程中提高糖苷水解酶的活性，是突出葡萄酒品種香氣的有效途徑，尤其適用于萜烯類物質含量較高的麝香類葡萄品種的葡萄酒。近些年來，隨著對NSC研究的深入，發現NSC較S. cerevisiae含有更多的糖苷水解酶，將其應用于葡萄酒的釀造，對于促進葡萄酒中結合態糖苷香氣物質的水解，增加游離香氣成分含量和種類起到積極促進作用[41-42]。表4數據表明，混菌發酵后萜烯醇類物質總量顯著升高，很可能與HBKS-Y 2具有一定的糖苷水解酶活性有關。本課題組會進一步考察HBKS-Y 2的水解酶系、糖苷酶活性及其釀造因子耐性，以揭示該NSC對玫瑰香干紅葡萄酒香氣的影響機制，為葡萄酒香氣的調控等相關研究提供參考數據。

4 結 論

本實驗從昌黎玫瑰香干紅葡萄酒自然發酵醪中分離獲得3 株優勢酵母，對其釀造特性及單菌、混菌發酵進行分析。發現，3 株本土酵母單菌和混菌發酵均符合干紅葡萄酒釀造的標準；同時，與H. uvarum HBKS-Y2單菌發酵相比，混菌發酵降低總酸、揮發酸及乙酸乙酯含量；與S. cerevisiae HBKS-Y1和HBKS-Y3單菌發酵相比，混菌發酵酒樣高級醇含量顯著降低；雖然混菌發酵香氣種類比活性干酵母發酵較少，但本土酵母發酵，無論單菌還是混菌發酵，表征玫瑰香葡萄品種香氣的萜烯醇類物質總量均高于活性干酵母發酵。以上結果表明，3 株本土酵母混菌發酵，在玫瑰香干紅葡萄酒釀造中具有一定的應用潛力，有助于突出玫瑰香干紅葡萄酒的品種香氣。

[1] 龐紅勛, 崔艷, 劉金福, 等. 本土葡萄酒酵母的選育及發酵性能[J].食品研究與開發, 2010, 31(6): 169-173.

[2] HEARD G. Novel yeasts in w ine making looking to the future[J].Food Australia, 1999, 51(8): 347-352.

[3] SUZZI G, ARFELLI G, SCHIRONE M, et al. Effect of grape indigenous Saccharomyces cerevisiae strains on M ontepulciano d’ Abruzzo red w ine quality[J]. Food Research International, 2012,46(1): 22-29. DOI:10.1016/j.foodres.2011.10.046.

[4] SUN Y, GUO J J, LIU F B, et al. Identification of indigenous yeast flora isolated from the five w ine grape varieties harvested in Xiangning, China[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2014, 105(3): 533-540. DOI:10.1007/s10482-013-0105-0.

[5] MEDINA K, BOIDO E, FARIüA L, et al. Increase flavour diversity of Chardonnay w ines by spontaneous fermentation and co-fermentation w ith Hanseniaspora vineae[J]. Food Chem istry, 2013, 141(3): 2513-2521. DOI:10.1016/j.foodchem.2013.04.056.

[6] CAPECE A, ROMANIELLO R, SIESTO G, et a1. Selection of indigenous Saccharomyces cerevisiae strains for N rod’Avola w ine and evaluation of selected starter implantation in pilot fermentation[J].International Journal of Food M icrobiology, 2010, 144(1): l87-192.DOI:10.1016/j.ijfoodm icro.2010.09009.

[7] MASSERA A, ASSOF M, STURM M E, et al. Selection o f indigenous Saccharomyces cerevisiae strains to ferment red musts at low temperature[J]. Annals of M icrobiology, 2012, 62(1): 367-380.DOI:10.1007/s13213-011-0271-0.

[8] 史學偉. 新疆石河子地區非釀酒酵母菌多樣性及其對葡萄酒呈香效應研究[D]. 武漢: 華中農業大學, 2015: 51-67.

[9] GOBB I M, COM ITIN I F, DOM IZIO P, et al. Lachancea thermotolerances and Saccharomyces cerevisiae in simultaneous and sequential co-fermentation: a strategy to enhance acidity and improve the overall quality of w ine[J]. Food M icrobiology, 2013, 33(2): 271-281. DOI:10.1016/j.fm.2012.10.004.

[10] REGODóDóN J A, PéREZ F, VALDéS M, et al. A sim ple and effective procedure for selection of w ine yeast strains[J]. Food M icrobiology, 1997, 14(3): 247-254. DOI:10.1006/fm ic.1996.0091.

[11] MOREIRA N, MENDES F, DE PINHO P G, et al. Heavy sulphur com pounds, higher alcoho ls and esters p roduction p rofile o f Hanseniaspora uvarum and Hanseniaspora guilliermondii grow n as pure and m ixed cultures in grape must[J]. International Journal of Food M icrobio logy, 2008, 124(3): 231-238. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2008.03.025.

[12] FLEET G H. Yeast interactions and w ine flavour[J]. International Journal of Food M icrobiology, 2003, 86(1/2): 11-22.

[13] 張強, 郭元, 韓德明. 釀酒酵母乙醇耐受性的研究進展[J]. 化工進展,2014, 33(1): 187-192.

[14] GREPPI A, RANTISOU K, PADONOU W, et al. Yeast dynam ics during spontaneous fermentation o f mawè and tchoukoutou,tw o traditional products from Benin[J]. International Journal of Food M icrobio logy, 2013, 165(2): 200-207. DOI:10.1016/j.ijfoodm icro.2013.05.004.

[15] FLEET G H. The m icrobiology of alcoholic beverages[M]//M icrobiology of Fermented Foods. Springer US, 1998: 217-262.

[16] JOLLY N P, AUGUSTYN O P H, PRETORIUS I S. The role and use of non-Saccharomyces yeasts in w ine production[J]. South A frican Journal of Enology and Viticulture, 2006, 27(1): 15-39.

[17] 凌云, 楊雪峰, 郭艾英, 等. 昌黎產區釀酒葡萄果表的酵母分離及發酵性能[J]. 食品科技, 2014, 39(12): 7-12.

[18] 蔣文鴻, 嚴斌, 陶永勝. 昌黎赤霞珠葡萄相關釀酒酵母的分離與篩選[J]. 食品工業科技, 2014, 35(12): 202-209.

[19] 楊美景. 河北省昌黎釀酒葡萄產區相關酵母菌分布規律研究[D]. 石家莊: 河北科技大學, 2011: 14-49.

[20] 薛軍俠, 徐艷文, 楊瑩, 等. WL培養基在釀酒酵母篩選中的應用[J].中國釀造, 2007, 26(9): 36-39.

[21] SIPICZKI M, POMANO P, LIPANI G, et al. Analysis of yeasts derived from natural fermentation in a Tokaj w inery[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2001, 79(1): 97-105.

[22] PéREZ-COELLO M S, BRIONES PéREZ A I, UBEDA IRANZO J F,et al. Characteristics of w ines fermented w ith different Saccharomyces cerevisiae strains isolated from the La M ancha region[J]. Food M icrobiology, 1999, 6(16): 563-573.

[23] MOREIRA N, PINA C, MENDES F, et al. Volatile compounds contribution of Hanseniaspora guilliermondii and Hanseniaspora uvarum during red wine vinifications[J]. Food Control, 2011, 22(5):662-667. DOI:10.1016/j.foodcont.2010.07.025.

[24] SW IEGERS J H, PRETORIUS I S. Yeast modulation of w ine flavor[J]. Advance App lied M icrobio logy, 2005, 57: 131-175.DOI:10.1016/S0065-2164(05)57005-9.

[25] CORDERO-BUESO G, ESTEVE-ZARZOSO B, CABELLOS J M, et al. Biotechnological potential of non-Saccharomyces yeasts isolated during spontaneous fermentation of Malvar (Vitis vinifera cv.L.)[J]. Europe Food Research Technology, 2013, 236(1): 193-207.DOI:10.1007/s00217-012-1874-9.

[26] ASSIS M O, SANTOS A P C, ROSA C A, et al. Impact of a non-Saccharomyces yeast isolated in the Equatorial region in the acceptance of wine aroma[J]. Food and Nutrition Sciences, 2014, 5(9):759-769. DOI:10.4236/fms.2014.59086.

[27] CIAN I M, COM ITIN I F, M ANNAZZU I, et al. Contro lled m ixed culture fermentation: a new perspective on the use of non-Saccharomyces yeasts in w inemaking[J]. FEMS Yeast Research, 2010,10(2): 123-133. DOI:10.1111/j.1567-1364.2009.00579.x.

[28] CIANI M, BECO L, COM ITINI F. Fermentation behaviour and metabolic interactions of multistarter w ine yeast fermentations[J].International Journal of Food M icrobiology, 2006, 108(2): 239-245.DOI:10.1016/j.ijfoodm icro.2005.11.012.

[29] SM ID E J, LACROIX C. M icrobe-m icrobe interactions in m ixed culture food fermentations[J]. Current Opinion in Biotechnology,2013, 24(2): 148-154. DOI:10.1016/j.copbio.2012.11.007.

[30] PéREZ-NEVADO F, ALBERGARIA H, HOGG T, et al. Cellular death of two non-Saccharomyces w ine-related yeasts during m ixed fermentations w ith Saccharomyces cerevisiae[J]. International Journal of Food M icrobiology, 2006, 108(3): 336-345. DOI:10.1016/j.ijfoodm icro.2005.12.012.

[31] ALBERGARIA H, FRANCISCO D, GORI K, et al. Saccharomyces cerevisiae CCM I 885 secretes peptides that inhibit the grow th of some non-Saccharomyces wine-related strains[J]. Applied Microbiology Biotechnology, 2010, 86(3): 965-972. DOI:10.1007/s00253-009-2409-6.

[32] ANDORRà I, BERRADRE M, ESTEVE-ZARZOSO B, et al.Effect of m ixed culture fermentation on yeast populations and aroma pro file[J]. LWT-Food Science Techno logy, 2012, 49(1): 8-13.DOI:10.1016/j.lw t.2012.04.008.

[33] BRANCO P, FRANCISCO D, CHAMBON C, et al. Identification of novel GAPDH-derived antim icrobial peptides secreted by Saccharomyces cerevisiae and invo lved in w ine m icrobial interactions[J]. Applied M icrobiology Biotechnology, 2014, 98(2):843-853. DOI:10.1007/s00253-013-5411-y.

[34] SUN S, GONG H, JIANG X, et al. Selected non-Saccharomyces w ine yeasts in controlled multistarter fermentations with Saccharomyces cerevisiae on alcoholic fermentation behaviour and wine aroma of cherry wines[J]. Food M icrobiology, 2014, 44(6): 15-23. DOI:10.1016/j.fm.2010.12.001.

[35] HONG Y A, PARK H D. Role of non-Saccharomyces yeasts in Korean w ines produced from Campbell Eearly grapes: potential use of Hanseniaspora uvarum as a starter culture[J]. Food M icrobiology,2013, 34(1): 207-214. DOI:10.1016/j.fm.2012.12.011.

[36] ROJAS V, GIL J, PI?AGA F, et al. Acetate ester formation in w ine by m ixed cultures in laboratory fermentations[J]. International Journal of Food M icrobiology, 2003, 86(1/2): 181-188.

[37] PLATA C, M ILLáN C, MAURICIO J C, et al. Formation of ethyl acetate and isoam y l acetate by species of w ine yeasts[J]. Food M icrobiology, 2003, 20(2): 217-224.

[38] RAPP A, MANDERY H. W ine aroma[J]. Experientia, 1986, 42(8):873-884.

[39] 陶永勝, 彭傳濤. 中國霞多麗干白葡萄酒香氣特征與成分關聯分析[J]. 農業機械學報, 2012, 43(3): 130-139. DOI:10.6041/j.issn.1000-1298.2012.03.025.

[40] LOSCOS N, HERNANDEZ P, CACHO J, et al. Release and formation of varietal aroma compounds during alcoholic fermentation from nonfloral grape odorless flavor precursors fractions[J]. Journal of Agricultural and Food Chem istry, 2007, 55(16): 6674-6684.DOI:10.1021/jf0702343.

[41] MATURANO Y P, ASSAF L A R, TORO M E, et al. Multi-enzyme production by pure and m ixed cultures of Saccharomyces and non-Saccharomyces yeasts during w ine fermentation[J]. International Journal of Food M icrobiology, 2012, 155(1/2): 43-50. DOI:10.1016/j.ijfoodm icro.2012.01.015.

[42] GAENSLY F, AGUSTINI B C, SILVA G A D, et al. Autochthonous yeasts w ith β-glucosidase activity increase resveratrol concentration during the alcoholic fermentation of Vitis labrusca grape must[J].Journal of Functional Foods, 2015, 19: 288-295. DOI:10.1016/j.jff.2015.09041.

Screening, Identification and Potential Use of Indigenous Yeasts from Muscat W ine Spontaneous Fermentation

YAN Hejing1, SHI Yue1, LIU Chang1, ZHAO Linlin2
(1. College of Food Science & Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Changli 066600, China;2. Wuhan Scientific Research & Design Institute, State Administration for Grain Reservation, Wuhan 430079, China)

Developing indigenous yeast strains is currently one of the most important trends in the production of featured Muscat w ine. In this work, 337 yeasts were isolated by using PDA medium from spontaneously fermented Muscat w ine,and then they were identified, counted and classified into seven groups by using Wallerstein laboratory (WL) solid medium.According to the results of yeast counting, the dominant strains were determined and then they were inoculated to bismuth sulphite glucose glycine yeast (BIGGY) agar to select yeast strains w ithout H2S production ability, and the selected strains were molecularly identified for further characterization of enological traits. The physicochemical indexes and volatile compounds of Muscat w ine fermented w ith these yeasts in mono-cultures or co-cultures were studied. Based on our experimental results, the potential of using these autochthonous yeast strains in Muscat w ine production were discussed.Out of 337 yeast strains, three were selected for less or no H2S production, which were cataloged as HBKS-Y1, HBKS-Y2 and HBKS-Y 3, and molecularly identified as Saccharomyces cerevisiae, Hanseniaspora uvarum and Saccharomyces cerevisiae, respectively. The alcohol, SO2and sugar tolerance of the 3 yeast strains were high and met the requirements of w ine vinification. When they were used to must fermentation either in mono- or co-culture, the physicochem ical indexes including reducing sugar, alcohol, total acids, volatile acids, glycerol and acetaldehyde contents were w ithin the range for dry red w ine. In mono-culture fermentation, HBKS-Y2 was a strong producer of total and volatile acids. When HBKS-Y2 was co-cultured w ith HBKS-Y 1 and HBKS-Y 3, a synergistic effect was observed, which resulted in a decrease in total acids content and a significant decrease in volatile acids content compared w ith single culture of HBKS-Y2 while havingno disadvantageous effects on the physicochem ical indexes of w ine. Furthermore, significantly higher contents of terpene alcohols, the characteristic aroma compounds of Muscat w ine, were produced by fermentation w ith indigenous yeasts especially in co-cultures compared w ith dry active yeast. These results suggest that HBKS-Y1, HBKS-Y2, and HBKS-Y3 can be used as a fermentation starter for Muscat w ine, and their co-culture has potential use in improving the variety-specific aroma of Muscat w ine.

Muscat w ine; indigenous yeast; screening; identification; enological characteristics; co-culture fermentation

2017-01-04

河北省教育廳項目（QN2014143）；河北科技師范學院博士科研啟動基金項目；秦皇島市科學技術研究與發展計劃項目（201101A176）

閻賀靜（1978—），女，副教授，博士，主要從事釀造微生物學研究。E-mail：yhj2203yhj@163.com

10.7506/spkx1002-6630-201722018

TS262.6

A

1002-6630（2017）22-0117-08

閻賀靜, 時月, 劉暢, 等. 玫瑰香干紅葡萄酒自然發酵過程中優勢酵母分離鑒定及其應用潛力分析[J]. 食品科學, 2017,38(22): 117-124. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722018. http://www.spkx.net.cn

YAN Hejing, SHI Yue, LIU Chang, et al. Screening, identification and potential use of indigenous yeasts from Muscat w ine spontaneous fermentation[J]. Food Science, 2017, 38(22): 117-124. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722018. http://www.spkx.net.cn