動物雙歧桿菌RH對消化道的耐受性及其微膠囊制備的研究

李 軍，張麗末，桂 萌，劉 蕾，郭秀鋒，李平蘭,*

（1.北京食品營養與人類高精尖創新中心，中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.北京市水產科學研究所，北京 100071）

動物雙歧桿菌RH對消化道的耐受性及其微膠囊制備的研究

李 軍1，張麗末1，桂 萌2，劉 蕾1，郭秀鋒1，李平蘭1,*

（1.北京食品營養與人類高精尖創新中心，中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.北京市水產科學研究所，北京 100071）

采用耐胃酸、耐膽鹽、模擬胃液和模擬腸液的獨立影響實驗和連續模擬消化道實驗考察動物雙歧桿菌對消化道環境的耐受性，結果表明：動物雙歧桿菌RH經各獨立實驗后活菌數仍保持在107CFU/m L，經連續模擬消化道實驗后活菌數為106CFU/m L。采用單因素試驗和正交試驗對動物雙歧桿菌RH微膠囊壁材進行優化，結果表明：動物雙歧桿菌RH最佳凍干保護劑各組成質量分數分別為甘油10%、海藻酸鈉0.5%、乳清蛋白1.5%、阿拉伯膠1.25%和大豆卵磷脂1.25%，該條件下制備的凍干微膠囊活菌數為1.80×1012CFU/g，平均包埋效率為96.04%。結論：動物雙歧桿菌RH對人工模擬消化道具有較好的耐受性，經壁材優化后制備的凍干微膠囊有較高的活菌數和較好的腸溶性。本研究為動物雙歧桿菌RH益生菌產品的開發提供理論基礎和技術支撐。

動物雙歧桿菌RH；消化道逆環境；凍干微膠囊

隨著生活水平的提高，人們對營養、健康的需求也日益增長。雙歧桿菌具有調節腸道菌群平衡、增強人體免疫系統、抗腫瘤等作用，已被廣泛應用于各類食品中[1-5]。

動物雙歧桿菌RH為本實驗室從廣西巴馬百歲長壽老人糞便中分離獲得的一株優良菌株。劉麗莎等[6]通過形態學、生理生化和分子鑒定，確定雙歧桿菌RH為動物雙歧桿菌乳亞種，進一步通過PCR擴增得到RH菌的12個與胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）生物合成有關的基因，說明該菌自身能夠產生EPS[7-8]。劉蕾等[9]對該菌進行了全基因組測序，基因組信息（GenBank登錄號：CP007755.1）也表明該菌株具有EPS的生物合成特性。尚楠等[10-11]采用動物實驗研究RH菌株調節腸道菌群平衡能力，結果表明雙歧桿菌RH的活菌、將菌體破碎后所得胞內物及發酵后上清液都可以增加小鼠腸道內雙歧桿菌和乳酸菌的數量，降低產氣莢膜梭菌和腸球菌的數量，并使腸桿菌和擬桿菌恢復至正常水平，從而改善小鼠腸道菌群組成。李輝等[12]利用細胞模型研究EPS的免疫激活作用及其對結腸癌細胞的生長抑制效果，結果表明雙歧桿菌RH合成的EPS能夠增強巨噬細胞的吞噬活性且不影響巨噬細胞增殖；通過激活宿主免疫進一步發揮抗腫瘤活性。郭秀鋒[13]用該菌發酵南瓜、胡蘿卜復合果蔬汁，研究結果顯示該發酵果蔬汁營養豐富，酸甜適宜，口感良好，且具有較高的活菌數。以上研究結果顯示動物雙歧桿菌RH具有益生作用，具有開發成活性益生菌產品的巨大潛力。

嚴格厭氧的雙歧桿菌對環境極為敏感，環境中許多不利因素如氧氣、酸環境等均會導致雙歧桿菌存活率的降低，從而喪失生理活性[14-16]。通過將雙歧桿菌進行包埋制成微膠囊，能夠較好地提高雙歧桿菌在各種不利外界環境中的存活率，可實現其在機體腸道較好的釋放效果。雙歧桿菌微膠囊常用的壁材有3 類：海藻酸鈉、殼聚糖和阿拉伯膠等具有成膜性的碳水化合物；乳清蛋白和酪蛋白等具有乳化性和成膜性的蛋白質；吐溫80和卵磷脂等形成W/O乳濁液從而隔絕氧氣的脂類。目前工業上常用海藻酸鈉為壁材生產雙歧桿菌微膠囊[17-19]。

本研究采用人工模擬消化道環境的方法考察了動物雙歧桿菌RH對消化道逆環境的耐受性，并采用擠壓法制備了動物雙歧桿菌微膠囊，探究不同壁材制備的微膠囊對動物雙歧桿菌RH的保護作用，提高動物雙歧桿菌RH能夠有效抵御食品體系中的有害成分對菌體的破壞，為動物雙歧桿菌RH在食品工業中的應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與細胞

動物雙歧桿菌RH（Bifidobacterium animalis subsp.lactis RH）分離自中國廣西巴馬百歲老人的糞便。動物雙歧桿菌BB-12（Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12）為本實驗室保存菌種。

1.1.2 培養基

M RS肉湯培養基：蛋白胨1 0 g/L，酵母提取物5 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，葡萄糖20 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，肉浸膏10 g/L，K2HPO42 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫80 1 m L/L，M nSO4·4H2O 0.25 g/L。MRS瓊脂培養基：在MRS肉湯培養基的基礎上添加質量分數1.5%～1.8%瓊脂。

1.1.3 主要溶液

0.05 mol/L pH 2.2甘氨酸-鹽酸緩沖液的配制：分別配制50 m L 0.2 mol/L的甘氨酸溶液和44 m L 0.2 mol/L的鹽酸，混合后加水稀釋至200 m L；1/15 mol/L pH 6.98磷酸緩沖液的配制：將1/15 m o l/L的Na2HPO4溶液與1/15 mol/L的KH2PO4溶液按體積比3∶2的進行混合，搖勻即可；pH 7.4磷酸鹽緩沖液的配制：稱取NaCl 8.5 g，Na2HPO42.2 g，NaH2PO40.2 g，溶于1 000 m L去離子水中，混勻，用濃鹽酸將pH值調節至7.4。

食管到胃連續過程的模擬液：向MRS肉湯培養基中加入質量分數0.5%的胃蛋白酶，分別調pH值至5.5、4.6、3.8、2.8、2.3、2.0，用0.22 μm的微孔濾膜過濾備用。十二指腸模擬液：向MRS肉湯培養基中加入質量分數1.0%胰蛋白酶和0.3%的膽鹽，調節pH值至5.0，用0.22 μm的微孔濾膜過濾備用。回腸模擬液：用0.1 mol/L NaHCO3溶液將十二指腸模擬液pH值調至6.5，用0.22 μm的微孔濾膜過濾備用。固化液的配制：質量分數3%氯化鈣溶液，用1 mol/L鹽酸調節pH值至6.5，滅菌備用。解囊液的配制：十二水合磷酸氫二鈉溶液35.8 g/L，檸檬酸溶液10.5 g/L，滅菌備用。

1.2 儀器與設備

FA 10 0 4電子分析天平 上海天平儀器廠；SPX-250B-Z恒溫水浴鍋、YXQ-LS-SⅡ壓力蒸汽滅菌鍋上海博訊實業有限公司；TGL-20M臺式高速離心機長沙平凡儀器儀表有限公司；SCL-1300超凈工作臺北京賽伯樂儀器有限公司；S23C型pH計 上海雷磁儀器廠；DNP-9102恒溫恒濕培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；LGJ-12真空冷凍干燥 北京松源科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 消化道環境對動物雙歧桿菌RH的影響

1.3.1.1 獨立影響實驗

耐胃酸實驗：以MRS培養基為基礎，用濃鹽酸將其pH值分別調至2.0和3.0，以正常MRS培養基pH值為對照，充氮氣，121 ℃滅菌15 m in。按10%接種量接入活化后的動物雙歧桿菌RH菌種，37 ℃厭氧條件下分別作用0、1 h和2 h后取樣測定活菌數。以動物雙歧桿菌BB-12為對照。

耐膽鹽實驗：以MRS液體培養基為基礎，向培養基中加入質量分數0.3%的膽鹽，按照每管10 m L分裝，充氮氣，121 ℃滅菌15 m in，備用。將動物雙歧桿菌RH按最終體系菌體濃度109CFU/m L接種量接入上述含膽鹽的培養基中，37 ℃厭氧培養10 h，測定初始接種量和培養10 h后的活菌數，進行比較。以動物雙歧桿菌BB-12為對照。

模擬胃液實驗：以0.05 mol/L pH 2.2甘氨酸-鹽酸緩沖液為基礎，分裝到試管，充氮氣，121 ℃滅菌15 m in，再按0.5%添加量加入胃蛋白酶作為模擬胃液，按最終體系菌體濃度為109CFU/m L接種量接入已活化的動物雙歧桿菌RH液體菌種，37 ℃厭氧條件下分別作用0、1 h和2 h后取樣測定活菌數。以動物雙歧桿菌BB-12為對照。

模擬腸液實驗：以1/15 mol/L pH 6.98磷酸鹽緩沖液為基礎，分裝到試管，充氮氣，121 ℃滅菌15 m in，再按1.0%添加量加入胰蛋白酶作為模擬腸液，按10%的接種量接入已活化的動物雙歧桿菌RH液體菌種，37 ℃厭氧條件下分別作用0 h和10 h后取樣測定活菌數。以動物雙歧桿菌BB-12為對照。

1.3.1.2 模擬消化道體系的影響

將活力正常的動物雙歧桿菌RH按最終體系菌體濃度為109CFU/m L的量接入食管到胃的模擬液中。在pH 5.5模擬液中作用10 m in，離心收集菌體，接入pH 4.6模擬液中處理10 m in，收集菌體，接入pH 3.8模擬液中處理10 m in，收集菌體，接入pH 2.8模擬液中處理20 m in，接入pH 2.3模擬液中處理20 m in，收集菌體，接入pH 2.0模擬液中處理20 m in，收集菌體，測定活菌數。

將所收集菌體接入十二指腸模擬液，作用1.5 h，收集菌體，取樣測定活菌數。

將所收集菌體接入回腸模擬液，作用2.5 h，收集菌體，取樣測定活菌數。以相同條件處理的動物雙歧桿菌BB-12作為對照[20]。

1.3.2 動物雙歧桿菌RH微膠囊的制備

1.3.2.1 菌株的活化與培養

將動物雙歧桿菌RH菌種活化至2～3 代。按4%的接種量接種于MRS肉湯培養基中，37 ℃厭氧培養至15 h，之后4 500 r/m in離心10 m in，棄去上清液，用無菌生理鹽水洗滌2 次，4 500 r/m in離心10 m in，收集菌體，獲得動物雙歧桿菌RH菌泥，備用。

1.3.2.2 壁材的配制

甘油是公認的應用較多的凍干保護劑，將其添加至微膠囊壁材中，可提高雙歧桿菌的凍干存活率。劉云[21]研究發現質量分數20%甘油、3%乳清蛋白和2%海藻酸鈉制備的長雙歧桿菌BBMN68凍干微膠囊包埋效果和成型效果好，且具有較高的包埋率。本實驗在壁材溶液中添加質量分數20%甘油時，溶液黏度過大，嚴重影響了微膠囊的成型和包埋，因此本研究將質量分數10%甘油作為凍干保護劑添加至壁材溶液中。

配制質量分數分別為0.25%、0.50%、1.00%、1.50%和2.00%海藻酸鈉溶液，室溫下磁力攪拌至均勻分散，4 ℃靜置過夜，確保完全溶解，備用。

在海藻酸鈉最適添加量的基礎上，分別向溶液中添加乳清蛋白、阿拉伯膠和大豆卵磷脂，使乳清蛋白質量分數分別為0.50%、1.00%、1.50%和2.00%，阿拉伯膠質量分數分別為0.50%、1.00%和1.50%，大豆卵磷脂質量分數分別為0.50%、1.00%、1.50%和2.00%，室溫下磁力攪拌至均勻分散，4 ℃靜置過夜，確保完全溶解，備用。

1.3.2.3 凍干微膠囊的制備

將400 m L培養基培養的菌體離心后加入到160 g壁材中，使每克濕膠囊含菌量約109～1010CFU[21]，磁力攪拌混合均勻，用5 m L注射器將混合液垂直滴入磁力攪拌的質量分數3% CaCl2溶液中，固化30 m in[21]，用無菌生理鹽水洗滌3 次得到雙歧桿菌濕微膠囊。

將制備好的濕微膠囊均勻鋪滿培養皿，約1 cm厚，培養皿上覆蓋8 層紗布并扎緊，放入-20 ℃預凍12 h，然后進行真空冷凍干燥，凍干時間約48 h[13,21]。將所得凍干微膠囊裝于壓蓋瓶中密封，貯藏于-20℃，備用。

1.3.2.4 微膠囊活菌數的確定

稱取0.1 g凍干微膠囊，溶于9.9 m L解囊液中，于37 ℃條件下進行解囊，待完全崩解后采用亨蓋特厭氧滾管技術[22]測定解囊液中雙歧桿菌的活菌數。

1.3.3 正交試驗優化微膠囊壁材

根據單因素試驗結果，選擇乳清蛋白（A）、阿拉伯膠（B）、大豆卵磷脂（C）為影響因素，設計L9（34）正交試驗，見表1。研究各因素對微膠囊活菌數的影響，從而得到最優凍干保護劑復配配方。

表1 凍干保護劑配方優化正交試驗因素與水平Table 1 Coded level and corresponding actual levels of independent variables used in orthogonal array design

1.3.4 凍干微膠囊包埋效率[23-24]的測定

稱取0.1 g優化后制備的凍干微膠囊樣品2 份，分別置于9.9 m L的磷酸鹽緩沖液（pH 4.0）和模擬腸溶液（pH 6.8）中， 37 ℃恒溫培養箱振蕩處理45 m in，活菌計數。包埋效率計算公式[25]如下：

式中：EE為包埋效率/%；Ct為包埋于微膠囊中的雙歧桿菌活菌總數；C0為起始添加的雙歧桿菌活菌總數。

1.3.5 腸溶性實驗

稱取0.1 g優化后制備的凍干微膠囊樣品置于含有9.9 m L模擬腸液（pH 6.8）的厭氧管中，充氮氣，在37 ℃恒溫培養箱中振蕩培養，分別于0、1、2、3、4 h 和5 h取1 m L腸液進行稀釋，活菌計數。

1.4 數據分析

所有實驗均為3 組重復，以 ±s表示，采用SPSS 20.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 消化道環境對動物雙歧桿菌RH的影響

2.1.1 獨立影響實驗

2.1.1.1 耐胃酸實驗

圖1 對照菌株動物雙歧桿菌BB-12對胃酸的耐受性Fig. 1 Tolerability of the control strain to gastric acid

圖2 實驗菌株動物雙歧桿菌RH對胃酸的耐受性Fig. 2 Tolerability of Bifidobacterium RH to gastric acid

由圖1和圖2可知，正常條件下培養動物雙歧桿菌RH活菌數不斷增加，在pH 2.0條件下，培養1 h后，RH的活菌數對數值由原來的（8.82±0.09）（lg（CFU/m L））降至（7.82±0.11）（lg（CFU/m L）），培養2 h后降至（7.30±0.03）（lg（CFU/m L））。RH菌株在此條件下1 h后降低一個數量級，隨著時間的延長，活菌數逐漸降低，但降低幅度相對較慢。RH菌株在pH 3.0條件下作用2 h后，活菌數降低程度較小。

動物雙歧桿菌RH菌株的耐酸性與BB-12相當。通常胃酸的pH值為3.0左右，流體食物在胃內停留的時間一般為1～12 h，相對較短，在此條件下，動物雙歧桿菌RH的活菌數能保持在較高水平，具有較強的耐胃酸能力。

2.1.1.2 耐膽鹽實驗

圖3 動物雙歧桿菌RH對膽鹽的耐受性Fig. 3 Tolerability of Bifidobacterium RH to bile salt

由圖3可知，動物雙歧桿菌RH和對照菌株相比，在質量分數0.3%的膽鹽環境下，RH菌株有一定程度的生長，而對照菌株卻受膽鹽環境的影響較大，活菌數大幅降低，培養10 h后活菌數約比培養0 h時降低一個數量級。培養0 h時的活菌數是按照對照菌與實驗菌等量接入培養基后，迅速進行活菌計數的結果，而0 h時RH活菌數顯著高于對照組，說明對照菌株在膽鹽環境處理瞬間即造成嚴重損失。對于大多數食物來講，10 h足以通過腸道，尤其是流體食物。研究表明，動物雙歧桿菌RH對人體正常的膽鹽環境具有較好的耐受作用。

2.1.1.3 模擬胃液和模擬腸液實驗

圖4 人工模擬胃液對動物雙歧桿菌RH存活的影響Fig. 4 Effect of simulated gastric fluid on the survival of Bifidobacterium RH

圖5 人工模擬腸液對動物雙歧桿菌RH存活的影響Fig. 5 Effect of simu lated intestinal environment on the survival of Bifidobacterium RH

由圖4可以看出，R H的活菌數初始值為（9.42±0.09）（lg（CFU/m L）），在經過模擬胃液處理1 h后，活菌數降至（8.82±0.03）（lg（CFU/m L）），處理2 h后活菌數降為（7.93±0.05）（lg（CFU/m L））。動物雙歧桿菌RH在模擬胃液處理時，隨著時間延長，活菌數逐漸降低，且降低幅度基本保持一致，最后依然能夠保持在較高的數量級，與對照組相當。

由圖5可以看出，將動物雙歧桿菌RH在人工模擬腸液中培養10 h后，活菌數由初始的（8.83±0.11）（lg（CFU/mL））降為（8.23±0.05）（lg（CFU/m L）），仍保持在較高活菌數水平，明顯優于對照組在模擬腸液環境下的存活率。孟祥晨[26]研究了模擬胃液環境對幾種雙歧桿菌的影響，不同菌株耐受能力不同，并且多數菌體在胃液處理前期活菌數降低幅度大，后期降低幅度小，對于導致菌株對胃腸液耐受能力差異的機制尚不明確。

2.1.2 連續模擬消化道體系實驗結果

人體消化道系統是一個連續的體系，消化管是一條起自口腔，延續為咽、食管、胃、小腸（包括十二指腸和空腸和回腸）、大腸終于肛門的肌性管道，外界食物進入人體后，需經過一系列過程到達小腸。研究動物雙歧桿菌RH對人體消化道逆環境的耐受性，需要模擬連續消化道體系來展開。雙歧桿菌活菌制劑食用時多為流體形式，在口腔及咽喉停留時間極短，據此本實驗通過配制食管到胃模擬液、十二指腸模擬液、系膜小腸（主要包括空腸和回腸）模擬液對動物雙歧桿菌RH菌株進行連續處理，觀察雙歧桿菌RH對整個消化道逆環境的耐受性。

圖6 連續模擬消化道體系對動物雙歧桿菌RH存活的影響Fig. 6 Effects of continuous simu lated gastrointestinal digestion on the survival of Bifidobacterium RH

由圖6可知，將初始量為（9.41±0.17）（lg（CFU/mL））的動物雙歧桿菌RH經過食管到胃連續過程后，活菌數降至（8.54±0.08）（lg（CFU/m L）），通過十二指腸模擬液后，活菌數降至（7.16±0.01）（lg（CFU/m L）），通過系膜小腸模擬液后，活菌數最終降至（6.94±0.06）（lg（CFU/m L）），經過連續腸道模擬環境后，動物雙歧桿菌RH的活菌數仍接近107CFU/m L，對照菌株在前兩個階段與RH菌株無顯著性差異，最后一階段降低幅度較大，最終活菌數降至（6.00±0.03）（lg（CFU/m L）），顯著低于動物雙歧桿菌RH。這說明動物雙歧桿菌RH對連續的消化道逆環境具有較好的耐受性。

關于益生菌對消化道逆環境的耐受性，國內外研究大都分別考慮菌株對胃酸的耐受性和對膽鹽的耐受性。Ranadheera等[27]研究了嗜酸乳桿菌LA-5及丙酸菌702對消化道的耐受性，分別用pH 2.0的胃酸溶液和0.3%的膽鹽溶液對實驗菌株進行處理，處理2～3 h后，活菌數有顯著降低。Pan Xiaodong等[28]通過研究不同pH值及膽鹽濃度下嗜酸乳桿菌LNT的存活率來研究該菌株對消化道環境的耐受性。消化道是一個完整的體系，有必要通過連續模擬消化道環境來分析菌株對消化道的耐受性，M adureira等[29]通過四步連續過程，分析了干酪乳桿菌LAFTI-L26和嗜酸乳桿菌LAFTI-10分別經過口腔、食管到胃、十二指腸和回腸過程后活菌數的變化，這種連續模擬方式與實際情況更接近。本實驗除單獨消化道因素對菌體的影響之外，采用完整消化道連續模擬了消化道逆環境對RH菌體的影響，更能反映真實情況。

2.2 動物雙歧桿菌RH微膠囊的制備

2.2.1 微膠囊壁材單因素試驗結果與分析

不同壁材對動物雙歧桿菌RH的生長影響如圖7所示。各因素對活菌數的影響結果表明，所選因素對活菌數的影響均為隨著添加量的增大凍干微膠囊活菌數先增長后下降。

如圖7A所示，當海藻酸鈉的添加量為0.50%時，凍干微膠囊的活菌數達到最大值，為5.50×109CFU/g，高于其他添加量（P＜0.05）。海藻酸鹽是一種從海藻中提取的帶負電荷天然大分子多糖，當與Ca2+接觸時，海藻酸鈉結構中的羧酸根陰離子與鈣離子之間交聯，結合成“蛋盒”式結構的海藻酸鈣，最終形成三維網絡狀的凝膠，將雙歧桿菌細胞截留在微膠囊中[30]。而且海藻酸鹽膠凝條件相對較溫和、安全無毒、生物相容性好且成本較低，在微生物包埋處理方面發揮著重要作用。

如圖7B所示，當乳清蛋白添加量為1.50%時，微膠囊中活菌數達到最大（6.95×1010CFU/g），比不添加乳清蛋白活菌數高出1 個數量級（5.50×109CFU/g）。在雙歧桿菌壁材體系中添加乳清蛋白可以在雙歧桿菌體外形成蛋白膜，該膜可以保護菌體細胞，同時乳清蛋白還可以為體系提供緩沖溶質，保持溶液的pH值相對穩定，并固定細胞中凍干的酶類[31]；此外，乳清蛋白變性，蛋白結構展開，經過相互作用形成聚集體，彌補了海藻酸鈉形成的多孔結構，增加了微膠囊的強度，使芯材較多的截留在微膠囊中。

由圖7C可知，當阿拉伯膠添加量為1.00%時，活菌數為3.23×1010CFU/g。阿拉伯膠為大分子多糖，含有特殊的結構，具有成膜性。

由圖7D可知，當大豆卵磷脂的添加量為1.00%時，活菌數達到9.20×1010CFU/g，此時微膠囊所含活菌數最大。體系中添加一定量的大豆卵磷脂時，有助于形成W/O的乳濁液體系，為雙歧桿菌提供厭氧的環境[23]，提高了微膠囊所含活菌數。

2.2.2 微膠囊壁材正交試驗結果與分析

設計L9（34）正交試驗優化壁材從而增大凍干微膠囊所含的活菌數，正交試驗結果如表2所示，凍干保護劑中乳清蛋白和大豆卵磷脂對凍干微膠囊活菌數具有顯著影響，阿拉伯膠的影響相對較小。

根據SPSS軟件分析各因素檢驗得到正交試驗的最優組合為A2B3C3，即乳清蛋白添加量為1.50%，阿拉伯膠添加量為1.25%，大豆卵磷脂添加量為1.25%。因此凍干保護劑中含質量分數分別為10%甘油，0.5%海藻酸鈉，1.5%乳清蛋白，1.25%阿拉伯膠和1.25%大豆卵磷脂。該條件下凍干微膠囊活菌數為1.80×1012CFU/g。劉云[21]以海藻酸鈉、乳清蛋白和甘油為壁材，利用擠壓法包埋長雙歧桿菌BBMN68，凍干后每克膠囊活菌數分別為9.66和10.6 個數量級。

圖7 海藻酸鈉（A）、乳清蛋白（B）、阿拉伯膠（C）和大豆卵磷脂（D）添加量對微膠囊所含活菌數的影響Fig. 7 Effects of sodium alginate (A), whey protein (B), Arabic gum (C) and soybean lecithin (D) concentration on the survival of m icroencapsuled Bifidobacterium RH

表2 壁材配方正交試驗設計及結果Tab le 2 Orthogonal array design w ith experimental resu lts

2.3 動物雙歧桿菌濕微膠囊的形態描述

微膠囊的外觀和大小是重要的物理因素，若將其添加至食品中，會對整體的風味、質地和外觀有顯著的影響。經壁材優化后制備的動物雙歧桿菌RH濕微膠囊形態如圖8所示，可以看出，微膠囊大小均一，表面光滑，乳白色，有光澤，呈規則球形，無拖尾現象，成型效果較好。對微膠囊粒徑進行測定，粒徑大約為1～2 mm。

圖8 動物雙歧RH濕態微膠囊形態Fig. 8 M orphology of wet m icrocapsules containing Bifidobacterium RH

2.4 包埋效率

根據1.2.4節方法得出凍干微膠囊包埋效率為96.04%，高于Holkem等[19]制備的雙歧桿菌BB-12凍干微膠囊的包埋效率（89.71%）。

2.5 腸溶性實驗結果

含有雙歧桿菌的制品必須能夠在人體腸道的堿性環境中完全快速的釋放出來，才能有效發揮其重要功效。雙歧桿菌微膠囊的腸溶性是評價凍干微膠囊的重要指標[32]，因此本研究對壁材優化后的凍干微膠囊進行了腸溶性實驗。

圖9 凍干微膠囊在模擬腸液中活菌數的變化Fig. 9 Change in survival rate of freeze-dried m icrocapsules in simulated intestinal fluid

由圖9可知，經模擬腸液處理1 h后，微膠囊形態發生變化，開始溶脹變大，溶液中活菌數迅速增加，達到1011CFU/g，2 h后腸液中活菌數約為1012CFU/g，此時微膠囊基本完全溶于腸液中，無明顯顆粒存在，之后雙歧桿菌活菌數趨于穩定。說明雙歧桿菌凍干微膠囊在腸道中2 h左右基本完全釋放。長雙歧桿菌BBMN68凍干微膠囊在模擬腸液中2 h內完成崩解[21]。動物雙歧桿菌RH微膠囊具有較好的腸溶性，能夠及時地溶解將包裹的動物雙歧桿菌RH釋放出來。

3 結 論

動物雙歧桿菌RH及其代謝產物胞外多糖具有抗腫瘤、免疫調節等多種生理活性，具有開發成益生菌產品的潛力。本研究考察了動物雙歧桿菌RH對消化道逆環境的耐受性，結果顯示經各獨立實驗后活菌數仍保持在107CFU/m L，經連續模擬消化道實驗后活菌數為106CFU/m L，符合規定的雙歧桿菌活菌體最低攝入量106CFU/m L的要求。這說明動物雙歧桿菌RH具有較好的消化道耐受性。動物雙歧桿菌RH具有多重益生作用，將其開發成益生菌產品是趨勢，而食品體系中有害成分會對菌體產生破壞作用，微囊化能夠有效地保護菌體抵御外界不利因素。本研究對RH微膠囊壁材進行優化，經壁材優化后制備的凍干微膠囊含有較高活菌數和較好的腸溶性。

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Resistance of Bifidobacterium RH to Simulated Gastrointestinal Conditions and Preparation of M icrocapsules Containing This Strain

LI Jun1, ZHANG Limo1, GUI Meng2, LIU Lei1, GUO Xiufeng1, LI Pinglan1,*
(1. Beijng Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Beijing Fisheries Research Institute, Beijing 100071, China)

The aim of this study was to evaluate the potential of Bifidobacterium RH to be used as a probiotic product. We examined the viability of the probiotic under simulated gastrointestinal conditions and we investigated the production of probiotic m icrocapsules w ith resistance to various negative factors. The bacterial counts were 107CFU/m L and 106CFU/m L,respectively, under simulated gastrointestinal conditions separately and sequentially. The optim ized wall material of m icrocasuples contained l0% glycerol, 0.50% sodium alginate, 1.50% whey protein, 1.25% Arabic gum and 1.25% soybean lecithin as determ ined by one-factor-at-a-time and orthogonal array designs. The count of viable Bifidobacterial cells in the m icrocapsules was 1.80 × 1012CFU/g, and w ith respect to encapsulation efficiency, the results showed a mean value of 96.04%. Thus, the study demonstrated that m icroencapsulated Bifidobacterium RH could be resistant to simulated gastrointestinal conditions. The m icroencapsulation process was shown to efficiently increase the viability of probiotic cultures, and the microorganism was released from the microcapsules. This study may provide a theoretical and technical support for the development of probiotic products containing Bifidobacterium RH.

Bifidobacterium RH; simulated gastrointestinal conditions; m icrocapsules

10.7506/spkx1002-6630-201722003

Q939.99

A

1002-6630（2017）22-0014-08

李軍, 張麗末, 桂萌, 等. 動物雙歧桿菌RH對消化道的耐受性及其微膠囊制備的研究[J]. 食品科學, 2017, 38(22): 14-21.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722003. http://www.spkx.net.cn

LI Jun, ZHANG Limo, GUI Meng, et al. Resistance of Bifidobacterium RH to simulated gastrointestinal conditions and preparation of microcapsules containing this strain[J]. Food Science, 2017, 38(22): 14-21. (in Chinese w ith English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722003. http://www.spkx.net.cn

2017-02-28

國家自然科學基金面上項目（31271827；31671831）

李軍（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：lijun900330@126.com

*通信作者：李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn