水溶性豌豆多糖的提取及性能研究

程 萌 齊軍茹 曹 靜

(華南理工大學食品科學與工程學院，廣州 510640)

水溶性豌豆多糖的提取及性能研究

程 萌 齊軍茹 曹 靜

(華南理工大學食品科學與工程學院，廣州 510640)

為了提升豌豆加工副產物——豌豆粉渣的高值利用化，以豌豆粉渣為原料，系統研究了不同的提取條件對水溶性豌豆多糖(Pea soluble polysaccharide, PSPS)得率及功能特性的影響，同時對PSPS的分子量，不同pH條件下的Zeta電位和酸性條件下的粒度分布進行測定，以及對其微觀結構進行觀察分析。研究結果表明,豌豆多糖的最佳提取工藝為：固液比1∶20，中性淀粉酶添加量為0.24%，酶解時間為 30 min；復合植物水解酶Viscozyme L添加量0.15%，酶解時間為30 min，除蛋白時間為30 min，pH 5.0，120 ℃高壓1.5 h。在此條件下的PSPS得率可達10.43% 且分散穩定性最優，其分子質量主要分布在252 kDa左右；在pH 3.5～11.0條件下，PSPS的電位絕對值高于水溶性大豆多糖(Soybean soluble polysaccharide, SSPS)，接近于高酯果膠(High methoxyl pectin, HMP)；在pH 3.6～4.6的環境中，PSPS粒度分布與SSPS相近。試驗表明PSPS是一種類似于SSPS且具有分散穩定性的多糖。

豌豆粉渣 水溶性豌豆多糖(PSPS) 提取 分散穩定性

豌豆(PisumsativumL．)屬于豆科豌豆屬，是第二大食用豆類作物，已在84個國家廣泛種植[1]。我國豌豆產量占全世界的三分之一，是世界第二大豌豆生產國[2]。豌豆中除了含有豐富的維生素和十余種人體必需的礦物質元素[3]外，其成熟籽粒中的蛋白質質量分數為21%～28%，淀粉質量分數為48%～52%，脂肪質量分數為1%～2.7%，粗纖維質量分數為4.5%～8.4%[4-5]。基于我國豐富的豌豆資源，豌豆淀粉及粉絲制品加工已形成很大的市場規模，用豌豆提取淀粉和蛋白質的副產品即為豌豆粉渣(豌豆纖維)，每年都有大量的加工副產物被工廠遺棄或用作動物飼料，很少有廠家進行豆渣的再回收利用，造成極大的環境污染與資源浪費[6]。然而，這些被廢棄的豆渣中卻含有具有功能特性的水溶性豌豆多糖(Pea soluble polysaccharide, PSPS)，其溶解性好、黏度低且無豆腥味，有望成為一種新型的食品添加劑[7]。隨著人們飲食觀念的改變，對酸性蛋白飲料的需求也越來越大，穩定性好，口感清爽，風味獨特是現代飲料的發展趨勢[8]。而酸性蛋白飲料中通常需要加入分散穩定劑來防止蛋白質在加工儲藏過程中的聚集沉淀[9-10]。水溶性植物多糖用于清爽型含乳蛋白飲料中，目前也被證明是最好的[11]。如今，水溶性大豆多糖(Soybean soluble polysaccharide, SSPS)在益力多、養樂多等飲料中已經得到了廣泛地應用，這為PSPS日后的市場開發與推廣提供了良好的借鑒。

目前，Asai等[12]和Nakamura等[13]對PSPS的提取、組成和應用等進行了研究。但國內對PSPS研究還較為罕見，本研究利用豌豆粉渣進行PSPS的制備和性能研究，不僅能變廢為寶，減輕環境污染，還能大大提高我國豌豆粉渣資源的利用價值，為PSPS的工業化生產及應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

豌豆粉渣：山東健源食品有限公司；水溶性大豆多糖：福建味博食品有限公司；脫脂乳粉(蛋白質量分數為33%)：新西蘭恒天然集團；高酯果膠：美國 CP Kelco公司；中性淀粉酶BAN 480L(480 KNU/g) 和復合植物水解酶Viscozyme L(100 FGB/g)：諾維信(中國)生物技術有限公司；其他生化試劑均為分析純。所有溶液均使用去離子水制備。

1.2 儀器與設備

YX-280型手提式壓力蒸汽滅菌器：合肥華泰醫療設備有限公司；B-290型噴霧干燥機：瑞士BUCHI 公司；Waters 1525 高效液相色譜儀: 美國Waters 公司；Mastersizer 2000 粒度分布儀：英國Malvern公司；MultiMode SPM 型原子力顯微鏡：美國Veeco 公司。

1.3 方法

1.3.1 PSPS的制備

取40 g 豌豆粉渣，加入去離子水按固液比1∶20充分攪拌后，60 ℃水浴1 h，添加中性淀粉酶(pH 6.5,50 ℃)和Viscozyme L(pH 5.0, 50 ℃)，再調節溶液至pH 8.0除去殘余蛋白。離心(8 000 r/min，20 min)后的沉淀加入適量去離子水攪拌，調節體系至pH 5.0，在120 ℃、0.1 MPa條件下高壓蒸煮1.5 h。冷卻后離心(8 000 r/min，20 min)取其上清液，通過噴霧干燥制得粉末狀的PSPS。

1.3.1.1 中性淀粉酶對PSPS得率及性能的影響

根據中性淀粉酶的使用特性，本試驗的中性淀粉酶添加量分別選取0、0.06%、0.12%、0.18%、0.24%、0.30%；酶解時間分別選取0、10、30、60、90 min，其他條件為：Viscozyme L添加0.15%，處理30 min；除蛋白30 min。考察中性淀粉酶的添加量和酶解時間對PSPS得率及性能的影響。

1.3.1.2 Viscozyme L對PSPS得率及性能的影響

設定Viscozyme L添加量分別為0、0.075%、0.15%、0.225%、0.30%，酶解時間分別為0、10、30、60、90 min，其他條件為：中性淀粉酶添加0.24%，酶解30 min；除蛋白30 min。考察Viscozyme L添加量和酶解時間對PSPS得率及性能的影響。

1.3.1.3 除蛋白時間對PSPS得率及性能的影響

豌豆渣中含有一定量殘留蛋白，在堿性的條件下可將這部分蛋白去除。設定除蛋白時間分別0、10、30、60、90 min，中性淀粉酶添加0.24%，處理30 min；Viscozyme L添加0.15%，酶解30 min。考察除蛋白時間對PSPS得率及性能的影響。

1.3.2 多糖得率計算

1.3.3 酸性蛋白飲料的制備

通過在酸性蛋白飲料中添加PSPS來評估其分散穩定性。將脫脂乳粉，多糖分別溶解于去離子水中，其中多糖在溶解前和白砂糖混合均勻。攪拌2 h后，將奶液緩慢加入到多糖溶液，混合成蛋白質量分數0.3%，多糖質量分數0.25%，白砂糖質量分數7%的溶液，用pH 3.0的檸檬酸、檸檬酸鈉緩沖液調節溶液pH為4.0～4.2。

1.3.4 酸性蛋白飲料沉淀率和濁度的測定

沉淀率：將配制好的酸性蛋白飲料搖勻，取一定量的樣品于離心管中，常溫下4 000 r/min離心20 min，離心后倒出上清液，倒置5 min 后稱重計算沉淀率。每個樣品進行3次平行試驗，取平均值。

濁度：吸取1 mL 上清，用去離子水稀釋10倍，在550 nm 波長下測定紫外吸光值。每個樣品進行3次平行試驗，取平均值。

1.3.5 PSPS分子質量的測定

采用高效凝膠色譜分析(GPC) 法將已知相對分子質量(Mr) 的葡聚糖標準品(Mr = 5.2、11.6、23.8、48.6、148、410、668、1 482 kDa)用0.02 mol/L 的用流動相配制成2.0 mg/mL 的溶液，進樣量20 μL，每個樣檢測時間為40 min，記錄色譜圖，以葡聚糖標準品的相對分子質量的對數(logMw)對洗脫體積(V)用Breeze1 GPC 數據軟件進行回歸處理，得到葡聚糖相對分子質量分布標準曲線及其回歸方程。色譜條件：TSK G-5000 PWXL column(7.8 mm×300 mm)和TSK G-3000 PWXL column(7.8 mm×300 mm)串聯，流動相為0.02 mol/L的KH2PO4緩沖溶液，流速為0.6 mL/min，waters 2414 示差檢測器，柱溫35 ℃。將自制的PSPS用0.02 mol/L 的用流動相配置成2.0 mg/mL 的溶液，在相同的條件下進行以上操作。

1.3.6 Zeta電位的測定

Zeta電位是帶電粒子平滑層產生的電勢。選擇滴定Zeta電位功能，將測量區間設定為pH值2.0～11.0。通過軟件運用相關數學模型測定Zeta 電位值。用去離子水稀釋樣品至質量濃度1 mg/mL，用粒度電位分析儀測定體系的Zeta 電位，在25 ℃進行測定。每個樣品重復測量3次取平均值。

1.3.7 動態光散射(DLS)粒度測量

納米粒度分析測量利用激光散射儀在90°散射角下進行，緩沖液調節溶液pH為3.6～4.6，溶液稀釋至多糖質量濃度為1 mg/mL，于25 ℃下測量，每個樣品重復測量3次取平均值。

1.3.8 原子力顯微鏡(AFM)測量

多糖分子形態信息通過原子力顯微鏡觀察獲得。將PSPS和SSPS充分溶于去離子水，配制成1 mg/mL溶液，用2 mmol/L的吐溫20稀釋到2 μg/mL。取2 μL樣品溶液分散于新鮮剝離的干凈云母片上，室溫下風干后用MultiModeSPM顯微鏡觀察。測試用輕敲模式成像。操作條件：掃描速度為1.0 Hz；頻率為320 kHz；共振頻率為290 kHz；硅懸臂長度為125 μm，曲率半徑為42 N/m。使用 Digital Nanoscope 軟件對AFM 圖片進行處理及分析。

2 結果與分析

2.1 中性淀粉酶添加量對PSPS得率及性能的影響

從圖1可以看出，隨著中性淀粉酶量的增加，PSPS的得率提高，PSPS穩定蛋白的溶液沉淀率下降，上清液濁度上升。當中性淀粉酶添加量到達0.24%后，沉淀率與上清液濁度均趨于平緩。這是因為淀粉酶能水解原料中的淀粉，同時也使豌豆渣結構變蓬松，添加淀粉酶越多，豌豆渣中的淀粉去除越徹底，最終高壓階段得到得率高分散穩定性佳的樣品。當中性淀粉酶添加量到達0.24%后，淀粉酶酶解效果接近飽和。為節約時間和資源，選取中性淀粉酶添加量為0.24%。

圖1 中性淀粉酶添加量對PSPS得率及穩定酸性乳飲料能力(沉淀率和濁度)的影響

2.2 中性淀粉酶酶解時間對PSPS得率及性能的影響

固定中性淀粉酶添加量0.24%，由圖2可得，隨著淀粉酶酶解時間的增加，PSPS得率提高，其穩定蛋白的溶液沉淀率降低，上清液濁度增大。當淀粉酶酶解時間到達30 min后，其得率上升緩慢，且沉淀率和上清液濁度均趨于不變。這是因為淀粉酶對原料的酶解時間越長，去除淀粉更充分，同時有利于原料結構的展開，最終得到量多、分散穩定性佳的樣品。但當酶解到達30 min以后，淀粉酶酶解效果接近飽和，所以選取中性淀粉酶酶解時長為30 min。

圖2 中性淀粉酶酶解時間對PSPS得率及穩定酸性乳飲料能力(沉淀率和濁度)的影響

2.3 Viscozyme L添加量對PSPS得率及性能的影響

為了研究Viscozyme L添加量對豌豆多糖得率的影響，固定Viscozyme L酶解時間為30 min，從圖3可以看出，隨著Viscozyme L量的增加，PSPS的得率呈明顯上升趨勢，其穩定的蛋白溶液隨著Viscozyme L添加量的增加沉淀率則先下降后上升，而上清液濁度先上升后下降。

添加Viscozyme L對PSPS的制備具有重要作用。一開始對原料中纖維進行有效的分解，使內部結構部分斷裂，有利于后續的高壓處理中PSPS的壓出；但Viscozyme L添加過量時，原料中纖維被水解過度，在后續高壓處理后得到的PSPS中含有較多的不具有分散穩定性的小分子糖。當Viscozyme L添加量為0.15%分散穩定性最優。

圖3 Viscozyme L 添加量對PSPS得率及穩定酸性乳飲料能力(沉淀率和濁度)的影響

2.4 Viscozyme L酶解時間對PSPS得率及性能的影響

由圖4可見，隨著Viscozyme L添加量的增加，PSPS在30 min處有最高得率，其穩定的蛋白溶液沉淀率先下降后上升，上清液濁度先上升后下降。這是因為當Viscozyme L反應時間較短時，原料中的纖維素水解不充分，其結構仍較緊密，故高壓階段多糖很難溶出，最終得率較低。隨著Viscozyme L反應時間增加，Viscozyme L充分水解，在酶解時間到達30 min時，原料被酶解的程度最佳，故高壓后得到得率最高的多糖。但隨著Viscozyme L酶解時間過長，原料中的纖維被過度處理，在后續高壓處理后得到的PSPS中含有較多的不具有分散穩定性的小分子糖。 Viscozyme L酶解最優時長為30 min。

圖4 Viscozyme L酶解時間對PSPS得率及穩定酸性乳飲料能力(沉淀率和濁度)的影響

2.5 除蛋白對PSPS得率及性能的影響

采用杜馬斯燃燒法測定豌豆粉渣中蛋白質質量分數為(14.45±0.11)%。從圖5可以看出，隨著除蛋白作用時間的增加，PSPS的得率呈明顯下降趨勢，當除蛋白時間超過30 min，得率下降趨勢趨于平緩。與此同時，PSPS穩定蛋白的溶液沉淀率呈先下降后上升趨勢，上清液濁度呈先上升后下降趨勢。

這是因為隨著除蛋白時間的增加，原料中的可溶性蛋白被去除，造成最終得到的PSPS得率降低，但分散穩定性得到有效的提高。作用時間達30 min以后，可能因為長時間的蒸煮導致原料中有部分PSPS損失,導致其穩定性能減弱。除蛋白時間為30 min時能兼顧PSPS得率與性能。

圖5 除蛋白時間對PSPS得率及穩定酸性乳飲料能力(沉淀率和濁度)的影響

2.6 PSPS分子質量分析

由圖6可以看出，PSPS分子質量最大峰的峰值為252 269左右，此峰占了分子質量分布的66.81%，此外，PSPS具有一個獨特的10 718的峰，占峰面積12.65%。此小分子質量峰出現與提取工藝有關，因PSPS未經乙醇純化，所以存在小分子糖。綜合Akihiro等[14]SSPS的研究表明，發現PSPS與SSPS的分子質量分布較為相似。由此認為，自制的PSPS的分散穩定性在分子質量層面上可能接近于SSPS的分散穩定性。

圖6 PSPS分子量分布

2.7 Zeta電位分析

由圖7可看出，在pH 2.0～11.0的條件下，高酯果膠(HMP)，SSPS始終帶負電荷，說明二者皆屬于陰離子多糖，這與前人結果一致[15-16]。隨著 pH值的上升，PSPS電位絕對值的不斷增大。并且，在pH到達3.5以后，PSPS 的電位絕對值逐漸高于SSPS的電位值并且接近HMP的電位值，證明其所帶負電荷高于SSPS而接近HMP。因此，從電位層面上分析， PSPS 是一種陰離子多糖，其穩定蛋白的能力一定程度上優于SSPS而與接近于HMP。

圖7 HMP、SSPS、PSPS溶液的Zeta電位值

2.8 粒徑分析

通過對PSPS和SSPS在pH 3.6～4.6之間粒徑分布的分析，從圖8可以看出，與HMP比，PSPS和SSPS的主峰更為接近，均主要分布在20～30 nm左右。當體系pH為4.0～4.6時，SSPS相較PSPS而言，主峰量下降，且在粒徑 500 nm附近分布更明顯。PSPS的粒徑則從pH3.6～4.6均沒有顯著的變化，非常穩定，可以預測PSPS的分散穩定能力應該比SSPS更優越。

圖8 HMP，SSPS和PSPS溶液在不同pH值條件下的粒徑分布

2.9 形貌學分析

AFM常用來對多糖分子的尺寸、表面形貌進行觀測，研究各多糖的性質[17]。根據lkeda等[18]的方法，通過吐溫-20作為稀釋劑從而增大多糖側鏈的展開,將樣品分散開的云母片置于原子力顯微鏡下觀察，結果見圖9。可以看出，HMP 微觀結構是類似于直線型的聚合物，SSPS和PSPS為星狀的多支鏈的聚合物。同時可以發現SSPS和PSPS的粒徑大小相近，主要分布在20～30 nm左右，而HMP的粒徑較大。充分表明PSPS是在微觀結構和粒徑大小都與SSPS極其相似的一類多糖。由此可以推測，PSPS會具有與SSPS相似的功能特性。

圖9 HMP、SSPS和PSPS溶液原子力電鏡圖

3 結論

通過單因素試驗確定酶輔助酸法提取PSPS的最優工藝為：固液比1∶20、中性淀粉酶添加量為0.24%，酶解時間為30 min；Viscozyme L添加量為0.15%，酶解時間為30 min；除蛋白時間為30 min，pH 5.0、120 ℃高壓1.5 h。在此工藝下得到的PSPS得率可達10.43%且分散穩定性佳。并通過Zeta電位及納米粒度分析儀，原子力顯微鏡等分析手段證明PSPS在分子質量分布、Zeta 電位、粒度分布以及微觀結構上都與SSPS極為相似。本研究大大提升了豌豆副產物的開發和利用，也為PSPS作為一種新型的食品添加劑在食品工業中的應用提供了參考。

[1]Roy F, Boye J I, Simpson B K. Bioactive proteins and peptides in pulse crops: pea, chickpea and lentil[J]. Food Research International, 2010, 43(2): 432-442

[2]顧競, 宗緒曉. 豌豆資源遺傳多樣性及核心種質研究進展[J]. 植物遺傳資源學報, 2009, 10(2): 334-337

Gu Jing, Zong Xuxiao. Research progress on pisum genetic diversity and core collection[J]. Journal of Plant Genetic Resources, 2009, 10(2): 334-337

[3]Sandberg A S. Bioavailability of minerals in legumes[J]. British Journal of Nutrition, 2002, 88(S3): 281-285

[4]秦清娟, 孫永林, 余海忠. 從豌豆果皮中制取葉綠素銅鈉鹽的工藝研究[J]. 安徽農業科學, 2011, 39(19) : 11942-11943

Qin Qingjuan, Sun Yonglin, Yu Hai-zhong. Technological study on preparing sodium copper chlorophyll from peel of pisum sativum linn[J]. Journal of Anhui Agricultural Science, 2011, 39(19) : 11942-11943

[5]李鳳英, 鄭立紅, 肖月娟, 等. 豌豆豆腐的研制[J]. 中國糧油學報, 2009, 24(2): 148-152

Li Fengying, Zheng Lihong, Xiao Yuejuan, et al．Preparation of pea tofu[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2009, 24(2): 148-152

[6]阮新，耿金培，王曉潔, 等. 豌豆粉絲中硒含量的測定[J]. 食品科學, 2008, 29(11): 527-531

Ruan Xin, Geng Jinpei, Wang Xiaojie, et al．Determination of selenium in pea vermicelli[J]. Food Science, 2008, 29(11): 527-531

[7]張守文，程宇. 豌豆的營養成分及在食品工業中的應用[J]. 中國食品添加劑, 2014(4): 154-158

Zhang Shouwen, Cheng Yu. The nutritional ingredient of pea and its application in food industry[J].China Food Additives, 2014(4): 155-158

[8]張亦瀾. 可溶性大豆多糖在酸性蛋白飲料中的應用研究[D]. 上海: 華東師范大學, 2013

Zhang Yilan. Application research on Soluble soybean polysaccharides in acidic protein drink[D]. Shanghai: East China Normal University, 2013

[9]Tromp R H, Kruif C G, Eijk M V, et al.On the mechanism of stabilization of acidified milk drinks by pectin[J]. Food Hydrocolloids, 2004,18(4): 565-572

[10]Nobuhara T, Matsumiya K, Nambu Y, et al. Stabilization of milk protein dispersion by soybean soluble polysaccharide under acidic pH conditions[J]. Food Hydrocolloids, 2014, 34: 39-45

[11]司華靜. 水溶性大豆多糖的提取及性能研究[D]. 廣州: 華南理工大學, 2007

Si Huajing. Extraction of soybean soluble polysaccharide and Properties study[D]. Guangzhou: South China University of Technology, 2007

[12]Asai Y, Yoshida Y, Tobe Nakamura A. Water-soluble garden pea polysaccharide composition used as dispersion stabilizer, comprises altooligosaccharide and maltopentaose, maltohexaose and maltoheptaose, in specified weight ratio: Japan,WO2015020024-A1[P]. 2015-02-12

[13]Nakamura A. Asai Y, Yoshida Y, et al. Dispersion stabilization of microparticles substance used for chemical and foodstuff applications e.g. food-drinks, involves using polar solvent containing microparticles substance and water-soluble garden pea polysaccharide: Japan,WO2014103987-A1[P]. 2014-07-03

[14]Nakamura A, Fujii N, Tobe N, et al. Characterization and functional properties of soybean high molecular mass polysaccharide complex[J]. Food Hydrocolloids, 2012, 29 (2) 75-84

[15]Dickinson E.Stability and rheological implications of electrostatic milk protein polysaccharide interactions[J]. Trends in Food Science and Technology,1998, 9(10):347-354

[16]Nakamura A, Furuta H, Maeda H, et al. Analysis of the molecular construction of xylogalacturonan isolated from soluble soybean polysaccharides[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2002,66(5):1155-1158

[17]鄭潔, 歐仕益, 蔡繼業. 原子力顯微鏡在食品科學中的應用[J]. 食品研究與開發, 2005, 26(5): 138-143

Zheng Jie, Ou Shiyi, Cai Jiye. The application of atomic force microscopy in food science [J]. Food Research and Development, 2005, 26(5): 138-143

[18]Ikeda S, Funami T, Zhang G. Visualizing surface active hydrocolloids by atomic force microscopy[J]. Carbohydrate Polymers, 2005, 62: 192-196.

Extraction and Characterization of Pea Soluble Polysaccharide

Cheng Meng Qi Junru Cao Jing

(College of Food Sciences and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640)

Pea residue, a by-product of pea processing, was investigated as a source of pea soluble polysaccharide (PSPS) to make the most of waste. The extraction factors which affect the yield and dispersion stability of PSPS were researched through single-factor experiments. The molecular weight, Zeta potential at different pH and the size distribution at acid condition of PSPS were determined, respectively. Meanwhile the molecular microstructure of PSPS was examined. The optimum technological conditions were shown as following: the ratio of material to liquid 1∶20, 0.24% of amylase additive amount with reaction time 30 min, 0.15% of Viscozyme L additive amount with reaction time 30 min, deproteinization time 30 min and heating at 120°C at pH 5.0 for 1.5 h. Under the above conditions, the yield of PSPS was 10.43% with great dispersion stability. The molecular weight of PSPS was distributed around 252 kDa. The absolute negative charges of PSPS from pH 3.5 to 11.0 were higher than those of soybean soluble polysaccharide (SSPS) and closed to high methoxyl pectin (HMP). The particle size distribution of PSPS was similar to SSPS at pH range from 3.6 to 4.6. It turned out that PSPS was polysaccharide with great dispersion stability like SSPS.

pea residue, pea soluble polysaccharide (PSPS), extracting, dispersion stability

TS 201.1

A

1003-0174(2017)10-0054-07

國家自然科學基金青年-面上連續資助項目(31370036)，中央高校基本科研業務費專項資金資助(2015ZZ119)

2016-08-12

程萌，女，1993年出生，碩士，蛋白物性修飾及功能性多糖

齊軍茹，女，1977年出生，教授，蛋白物性修飾及功能性多糖