Rcn3與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制的相關(guān)性

陳學(xué)正++王清華++楊東奇++馬潤林++石小倩

小鼠Reticulocalbin（RCN3）蛋白是一種定位于哺乳動(dòng)物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌途徑，含有6個(gè)EF-Hand結(jié)構(gòu)域的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子結(jié)合蛋白。為了研究Rcn3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制的相關(guān)性，我們利用前期獲得的Rcn3基因敲除小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料。將細(xì)胞分別用毒胡蘿卜素（TG）和衣霉素（TM）處理，并通過QPCR和Western Blot技術(shù)測得在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況下Rcn3基因和RCN3蛋白的表達(dá)量。在模型構(gòu)建成功的情況下，結(jié)果表明：1）Rcn3基因的表達(dá)量相比對照組均成上升趨勢。2）RCN3蛋白的表達(dá)量相比對照組均成上升趨勢。可得出結(jié)論：Rcn3基因及其編碼的蛋白R(shí)CN3蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制有關(guān)。

近年來，生物技術(shù)逐漸嶄露頭角，成為世界科研的主要潮流之一，生物研究的根本便是研究基因和基因所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)情況和在細(xì)胞、個(gè)體、種群層次上發(fā)揮的作用。由于生物技術(shù)與食品安全、生物制藥等方面的緊密關(guān)聯(lián)性，其具有重大的科研以及商業(yè)價(jià)值。生物技術(shù)也必將在未來為改善人類生活做出更重要、更不可或缺的貢獻(xiàn)。

研究背景

Rcn3簡介

小鼠Reticulocalbin（Rcn3）是一個(gè)單拷貝基因，基因序列號是BC055903，位于小鼠的第7號染色體上，包含有7個(gè)外顯子，翻譯起始位點(diǎn)（ATG）位于第二個(gè)外顯子上，分布在10kb的染色體范圍內(nèi)（基因組結(jié)構(gòu)示意圖如圖1[1]），預(yù)測編碼一個(gè)328個(gè)氨基酸的多

肽[2]。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，RCN3含有6個(gè)

EF-Hand結(jié)構(gòu)域，在C-末端含有一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號HDEL，結(jié)構(gòu)上非常保守，屬于近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)含6個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域，定位內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子結(jié)合蛋白家族Reticulocalbin。關(guān)于Rcn3的研究還很少，其基因功能仍然很不清楚。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum， ER）是真核細(xì)胞內(nèi)非常重要的多功能細(xì)胞器，在完成基本生理功能的同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)憑借其龐大的膜結(jié)構(gòu)成為協(xié)調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的樞紐平臺(tái)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是脂類和固醇合成、維持Ca2+動(dòng)態(tài)平衡、蛋白質(zhì)合成與折疊及其翻譯后修飾的場所[3-4]。

遺傳或環(huán)境損傷會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡、氧化應(yīng)激、營養(yǎng)缺乏、糖基化抑制和蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，從而破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[3-6]。本次研究使用毒胡蘿卜素（thapsigargin， TG）、衣霉素（tunicamycin， TM）處理小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，從而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程。

TG原理：TG是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶選擇性抑制劑，可以使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高。

TM原理：TM阻礙了蛋白中N-糖苷鍵的

形成。

圖1 小鼠RCN3蛋白質(zhì)序列，EF-Hand結(jié)構(gòu)域和蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

A：預(yù)測的小鼠RCN3氨基酸序列，紅色序列代表信號肽，藍(lán)色序列是預(yù)測的6個(gè)保守的EF-Hand結(jié)構(gòu)域。B：對應(yīng)于A中的6個(gè)在CREC家族中非常保守的EF-Hand結(jié)構(gòu)域。C：RCN3蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。

研究目的與意義

Tsuji A. 等人發(fā)現(xiàn)，人的RCN3蛋白嚴(yán)格定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，具有Ca2+結(jié)合活性[2]，且其具體功能尚不明確，故選擇RCN3作為研究對象。

本次實(shí)驗(yàn)利用已有的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）作為實(shí)驗(yàn)材料，通過TG和TM的處理，誘導(dǎo)細(xì)胞建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型。然后通過熒光定量PCR法（QPCR）和免疫印跡法（Western Blot）檢測在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，Rcn3基因和蛋白的表達(dá)量，從而得出Rcn3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制是否存在關(guān)聯(lián)。

Rcn3是通過生物信息學(xué)預(yù)測出來的基因，RCN3在人，大鼠，小鼠中都存在同源蛋白，并且小鼠RCN3和人RCN3的氨基酸同源性高達(dá)93% [1]。故通過對小鼠體內(nèi)Rcn3基因與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制是否關(guān)聯(lián)的研究，我們可以檢測或推斷出人類Rcn3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制的關(guān)聯(lián)性，從而對未來生命科學(xué)和生物制藥等方面的研究奠定一定的理論研究基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)方法與步驟

RNA的提取

1）準(zhǔn)備試劑：氯仿、異丙醇、75℅乙醇、無RNase的水。

操作步驟：

（1）單層培養(yǎng)細(xì)胞：在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積加1mL。

（2）將勻漿樣品在室溫（15℃～30℃）放置5min，至核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

（3）每使用1mLTRIzoL加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置5min。4℃12000r離心15min。

（4）把上層水相轉(zhuǎn)移到新管中，用異丙醇沉淀水相中的RNA，4℃放置30min，4℃12000r離心10min，棄去上清。

（5）用75%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃12000r離心5min，棄上清。

（6）室溫放置干燥RNA沉淀10min。加入30μl無RNase的水，55℃放置10min使RNA溶解，-70℃保存。

2）RNA反轉(zhuǎn)錄。

采用試劑盒為 HiFiScript cDNA Synt

hesis Kit（CWBIO），根據(jù)指導(dǎo)手冊進(jìn)行 cDNA 合成。

（1）模板 RNA Total RNA 3μg

Primer Mix（50 μL） 1μL

dNTP Mixture （10 mM each） 1μL

RNase-free water Up to 13μL

70℃ 保溫 10min 后， 冰上迅速冷卻。

（2）上述反應(yīng)液 13μL

5×RT Buffer 4μL

DTT 2μL

HiFiScript（200U/μL） 1μL

Total：20μL

（3）混勻后，50℃反應(yīng)15min。

（4）85℃，5 min 使酶滅活，冰上冷卻。

3）QPCR 體系。

MASTER MIX 5μl

正向引物（ 10μM） 0.5μl

反向引物（ 10μM） 0.5μl

DNA模板 50ng

ddH2O to 10μl

反應(yīng)條件：94℃，60s變性模板DNA；變性：94℃，30s；退火：58℃，30s；延伸：68℃， 1min/kb；35 cycles。68℃，10min；4℃，保存。

4）Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)。

（1）去離子水清洗1.5mm規(guī)格玻璃板，晾干待用。

（2）配膠：配制12%分離膠，用去離子水排氣泡封膠。膠已凝固時(shí)（約30min），傾去膠上的水后洗滌數(shù)次，并用濾紙將水吸干。配制5%的濃縮膠，將剩余空間灌滿濃縮膠然后立即將干凈且干燥的梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后（約30min），將凝膠放入電泳槽中，加入電泳液，排除凝膠底部兩塊玻璃板之間的氣泡，拔出梳子。

（3）蛋白上樣：電泳液沖洗濃縮膠上樣孔，水浴鍋煮沸去離子水，煮蛋白5min使之變性，立即冰浴，然后低速離心5min，進(jìn)行蛋白上樣。

（4）電泳：將電泳槽與電泳儀相接，跑濃縮膠時(shí)用80V電壓，到分離膠后改為120V直至蛋白跑至膠底。

（5）轉(zhuǎn)膜：半干法：從負(fù)極到正極方向依次為纖維墊、凝膠、PVDF膜、纖維墊，用轉(zhuǎn)膜液濕潤即可，限壓（20V）、限流（5.5倍膠面積mA）轉(zhuǎn)膜1小時(shí)。

（6）將膜用1×麗春紅染液染5min，去離子水輕輕沖洗，觀察蛋白轉(zhuǎn)膜情況，并根據(jù)目的蛋白位置裁剪PVDF膜，TBST洗去染液。

（7）封閉：將膜移入盛有5%脫脂奶粉的平皿中，室溫?fù)u床孵育1h，TBST洗膜。

（8）孵育一抗：用5%脫脂奶粉稀釋一抗，濕盒中4℃恒溫房搖床過夜。

（9）孵育二抗：傾去一抗，TBST室溫?fù)u床洗膜3～5次，每次5min～10min，5%脫脂奶粉稀釋相應(yīng)二抗，室溫?fù)u床孵育3h。

（10）曝光：傾去二抗，TBST室溫?fù)u床洗膜3～5次，每次5min～10min。將兩種發(fā)光劑按1：1的比例混合，避光孵育膜上蛋白2min～5min，傾去發(fā)光劑，準(zhǔn)備顯影。

（11）顯影：整個(gè)過程在暗室中。將膠片壓于已封發(fā)光劑的蛋白膜上，取出膠片后在顯影液中浸洗，適時(shí)在水中終止，將膠片放入定影液中定影，之后用水將膠片沖洗干凈，吹干。

結(jié)果與分析

QPCR結(jié)果

圖2

A：Rcn3敲除小鼠成纖維細(xì)胞TM處理后GRP78 mRNA表達(dá)情況。B：Rcn3敲除小鼠成纖維細(xì)胞TG處理后GRP78 mRNA表達(dá)情況。C：野生型小鼠成纖維細(xì)胞TM處理后GRP78 mRNA表達(dá)情況。D：野生型小鼠成纖維細(xì)胞TG處理后GRP78 mRNA表達(dá)情況。與對照組相比，所有處理樣本的GRP78 mRNA表達(dá)量上升。

圖3

A：野生型小鼠成纖維細(xì)胞TG處理后Rcn3 mRNA表達(dá)情況。B：野生型小鼠成纖維細(xì)胞TM處理后Rcn3 mRNA表達(dá)情況。與對照組相比較，所有處理組樣本的Rcn3 mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢。

Western Blot結(jié)果

圖4

免疫印跡法測得野生型和Rcn3基因敲除小鼠成纖維細(xì)胞在TM 和TG 處理后內(nèi)參蛋白（β-BUTULIN）、GRP78蛋白、RCN3蛋白表達(dá)情況。 內(nèi)參蛋白表達(dá)情況大體相同，說明上樣量基本一致。通過對比可知，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況下，RCN3蛋白表達(dá)量上升。

結(jié)論與展望

結(jié)論

1）所有小鼠成纖維細(xì)胞的GRP78 mRNA表達(dá)量均成上升趨勢，可得出結(jié)論：所有細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)皆產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)即ER stress模型建立

成功。

2）所有小鼠成纖維細(xì)胞的Rcn3 mRNA表達(dá)量均成上升趨勢，可得出結(jié)論：小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)Rcn3基因與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)聯(lián)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到刺激的情況下，Rcn3基因表達(dá)量上升。

3）所有小鼠成纖維細(xì)胞的RCN3蛋白表達(dá)量均成上升趨勢，可得出結(jié)論小鼠細(xì)胞內(nèi)RCN3蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制有關(guān)聯(lián)，與mRNA表達(dá)量變化趨勢大致相同。

展望

1）通過更改刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的藥品和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所處的環(huán)境，并多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定Rcn3基因和RCN3蛋白是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制存在關(guān)聯(lián)性。

2）通過對RCN3蛋白肽鏈組成、空間結(jié)構(gòu)等方面的探究，揭示該種蛋白及編碼其的基因在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下發(fā)揮的具體作用。

本次研究通過建立模型法成功證實(shí)了還未被廣泛研究和重視的Rcn3基因及其編碼的RCN3蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制具有顯著的相關(guān)性。在未來，通過對此種基因的進(jìn)一步研究和利用可以為生命科學(xué)的研究和利用做出更多、更重要的貢獻(xiàn)。

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（通訊作者：馬潤林，教授，博士生導(dǎo)師，中國科學(xué)院大學(xué)，研究方向?yàn)槿祟惣皠?dòng)物功能基因組學(xué)。

石小倩，博士，中國科學(xué)院大學(xué)，研究方向?yàn)檫z傳學(xué)。

作者簡介：陳學(xué)正，王清華，楊東奇，北京市牛欄山第一中學(xué)。）