響應面優化超聲提取狗棗獼猴桃葉粗多糖研究

陸娟，常清泉，譚莉，白曉仙，王海蓮

（長春師范大學化學學院，吉林長春130032）

響應面優化超聲提取狗棗獼猴桃葉粗多糖研究

陸娟，常清泉，譚莉，白曉仙，王海蓮

（長春師范大學化學學院，吉林長春130032）

以狗棗獼猴桃葉粗多糖得率為響應值，在單因素試驗的基礎上，采用三因素三水平響應面分析法（RSM），研究超聲輔助提取各因素對狗棗獼猴桃葉粗多糖得率的影響，優化超聲輔助提取狗棗獼猴桃葉粗多糖最優工藝；利用DPPH自由基清除試驗，測定狗棗獼猴桃葉多糖的抗氧化活性。結果表明：超聲輔助提取狗棗獼猴桃葉粗多糖最優工藝為超聲功率989.61 W，提取時間20.00 min，液固比為80∶1（mL/g），狗棗獼猴桃葉粗多糖得率理論值為5.59%，設定超聲功率990 W，提取時間20.00 min，液固比80∶1（mL/g）進行驗證試驗，狗棗獼猴桃葉粗多糖得率為5.41%。在此條件下得到的狗棗獼猴桃葉多糖具有清除DPPH自由基的能力，清除能力與濃度大小相關。

狗棗獼猴桃；多糖；超聲輔助提取；響應面法

狗棗獼猴桃[Actinidia kolomikta（Rupr.et Maxim.）Planch]，是獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬多年生藤本植物，深山木天蓼，俗稱狗棗子[1]。狗棗獼猴桃主要分布于我國東北、華北、華中、西北、西南等地，朝鮮、日本、俄羅斯等國家部分地區也有分布，其中吉林省長白山地區資源較為豐富[1]。據文獻報道，狗棗獼猴桃葉中含黃酮、有機酸、多糖、揮發油類等化合物[2]，常曉麗、金永日、陸娟等對狗棗獼猴桃葉乙醇提取物中的進行了研究[3-6]，分離得到多個黃酮類化合物和萜類化合物。

眾多的研究結果表明，多糖有調節免疫、抗病毒及抗癌、降血糖、刺激造血、抗病毒、美容等作用，并且對機體的毒副作用小[7]。狗棗獼猴桃葉的多糖是其重要的藥效物質，具有抗腫瘤、抗病毒、調節免疫等作用，頗具研究開發價值[8]。

近期，陸娟等利用響應面法優化了85%乙醇提取后的狗棗獼猴桃葉多糖微波提取工藝[9]，本文繼續以85%乙醇提取后的狗棗獼猴桃葉為原料，利用響應面法優化狗棗獼猴桃葉多糖超聲輔助提取工藝，利用DPPH自由基清除試驗研究狗棗獼猴桃葉多糖的抗氧化活性，為從狗棗獼猴桃葉中獲得食品用天然抗氧化劑的工業化生產提供理論參考，也為狗棗獼猴桃葉的充分利用提供了一種有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狗棗獼猴桃葉：吉林省靖宇縣；無水乙醇、95%乙醇、葡萄糖、濃硫酸、苯酚均為分析純；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：國藥集團化學試劑有限公司；抗壞血酸：上海試劑二廠；試驗用蒸餾水、超純水為有機化學實驗室自制。

1.2 儀器與設備

TU-1901型紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；SL-2010N超聲波信號發生器：南京順流儀器有限公司；Heraeus Multifuge X1R型高速離心機：ThermoFisher SCIENTIFIC。

1.3 方法

1.3.1 狗棗獼猴桃葉粗多糖的提取及樣品溶液的制備

準確稱取經85%乙醇提取后，干燥的狗棗獼猴桃葉粉末2.0 g，置于超聲提取器中，加入已設定的蒸餾水，浸泡12 h后，按照設定的超聲功率、提取一定時間，提取液離心，濃縮上層清液至一定體積，加3倍無水乙醇室溫下醇沉24 h、離心、得沉淀、脫水、干燥得粗多糖。

分別取10.0 mg粗多糖粉末，精密稱定后置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度線，配成樣品溶液，備用。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的繪制

葡萄糖標準曲線按照參考文獻[9]，以苯酚-硫酸法，測定葡萄糖濃度與吸光度之間的關系，繪制葡萄糖標準曲線，回歸方程為A=56.447C-0.047 3，C是葡萄糖濃度（mg/mL），A為吸光度，相關系數R2=0.999 3，線性范圍：0.001 0 mg/mL~0.012 0 mg/mL。

1.3.3 單因素試驗

在其他條件相同的情況下，分別研究超聲功率450、600、750、900、1 050、1 300 W、超聲時間 5、10、20、30、40、50 min、液固比 40∶1、60∶1、80∶1、100∶1、120∶1、140∶1（mL/g）3個因素對多糖提取得率的影響。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，采用三因素三水平Box-Benhnken Design（BBD）試驗設計方案，以超聲提取功率（A）、超聲時間（B）、液固比（C）為考察變量，以狗棗獼猴桃葉粗多糖提取率（Y）為響應值，應用Design-Expert8.0.5軟件，建立數學回歸模型，確定狗棗獼猴桃葉粗多糖的最佳超聲波提取工藝。試驗因素和水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.5 DPPH自由基清除試驗

按照參考文獻[10-11]方法，分別往2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液中加入不同濃度的多糖溶液2 mL，在暗處反應30 min后，在517 nm處測量其吸光度，按照公式 E=（ADPPH-As）/ADPPH計算清除率，其中：ADPPH為DPPH溶液吸光度值，As為樣品DPPH溶液吸光度。同時，用相應的VC溶液代替多糖溶液，測定VC的清除能力。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗分析

2.1.1 超聲功率對多糖提取率的影響

超聲功率對多糖提取率的影響見圖1。

圖1 超聲功率對粗多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of crude polysaccharide

由圖1可知，隨著超聲功率的增大，多糖提取率逐漸增大，但當超聲功率為900 W時，多糖提取率可達最大值，其后隨著功率的增大，多糖提取率反而逐漸降低。這可能是由于超聲通過空化效應，破壞植物細胞壁，使組織細胞內部的多糖成分與溶劑充分接觸而快速溶解轉移[11]，超聲功率增大，較多的多糖可以滲透細胞膜進入細胞和溶劑，然而，過高的功率會可能會致使多糖解聚、聚合和黏度降低，這將導致提取得率減少[12]，因此選擇最佳超聲功率為900 W。

2.1.2 超聲時間對多糖提取率的影響

超聲時間對多糖提取率的影響見圖2。

圖2 超聲時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield rate of polysaccharide

由圖2可知，隨著超聲時間的延長，多糖提取率呈現增大的趨勢，當超聲時間為20 min時，多糖提取率達到最大，其后隨著提取時間的增大，多糖提取率有所下降。這可能是因為超聲時間過長，可能會誘導部分多糖的降解[13]，因此，最佳提取時間是20 min。

2.1.3 液固比對多糖提取率的影響

液固比對多糖提取率的影響見圖3。

圖3 液固比對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield rate of polysaccharide

由圖3可知，隨著液固比的增大，多糖提取率逐漸增大，當液固比為80∶1（mL/g）時，多糖提取率達到最大，其后隨著液固比的增大，多糖提取率反而逐漸降低。因此最佳液固比為80∶1（mL/g）。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結果

響應面試驗設計結果見表2。

表2 響應面試驗設計及響應結果Table 2 RSM design and response result values

通過Design-Expert8.0.5軟件對表2中的響應面試驗結果進行回歸分析，以狗棗獼猴桃葉粗多糖的提取率（Y）為因變量，超聲功率（A）、超聲時間（B）以及液固比（C）為自變量，進行回歸分析，得到二次多項回歸模擬方程：Y（%）=6.70-0.48A+0.73B+0.98C-0.75AB-1.04AC+0.40BC-2.30A2-2.60B2-2.13C2。對上述回歸模型進行F檢驗，判定回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性，概率越小，則相應變量的顯著程度越高，方差分析結果見表3。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

由方差分析表3可以看出，模型F=158.53，p＜0.000 1差異有統計學意義，說明建立的模型極顯著（p＜0.01）；失擬項 F=0.21，P=0.475 5，失擬項相對于絕對誤差不顯著，說明模型的擬合程度良好，未知因素對試驗結果干擾很小。模型R2=0.9203，Adj R2=0.8889，表明模型與實際試驗擬合較好，試驗誤差較小，可以用此模型對狗棗獼猴桃葉粗多糖的超聲輔助提取進行分析和預測。對回歸方程系數進行顯著性檢驗，表明超聲功率、超聲時間、液固比、3個因素之間的交互作用及三因素的二次項均對（A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2）對狗棗獼猴桃葉粗多糖的提取率影響均顯著（p＜0.05）。

2.2.2 雙因子交互作用分析

回歸方程所繪制的三維（3D）響應面和二維（2D）等高線生成的模型圖見圖4～圖6。

圖4 超聲功率和提取時間對多糖提取得率影響的響應曲面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing effect of ultrasonic power and extraction time

由圖4為超聲功率（A）和超聲時間（B）對多糖提取率的影響，由圖可知，從750 W到900 W范圍內，超聲功率（A）增加多糖提取得率也相應增加，但當超聲波功率超過900 W，提取率反而下降。從時間角度得出，10 min到25 min范圍內，逐漸增加超聲時間，多糖提取得率也會相應增加，但超過25 min后多糖得率下降。

超聲功率（A）和液固比（C）交互作用對多糖提取得率的影響見圖5。

圖5 超聲功率和液固比對多糖提取得率影響的響應曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing effect of ultrasonic power and liquid-solid ratio

由圖5可以得出，液固比從60∶1（mL/g）增加到90∶1（mL/g）時，多糖提取得率增加，液固比超過90∶1（mL/g）時，多糖提取率下降。超聲功率（A）從750增加到900 W時，多糖提取得率也相應增加，但當超聲功率超過900 W，提取率反而下降。

液固比（C）和超聲波提取時間（B）交互作用對多糖提取得率的影響見圖6。

圖6 液固比和提取時間對提取得率的影響Fig.6 Response surface and contour plots showing effect of extraction time and liquid-solid ratio

由圖6可以得出，液固比在60∶1（mL/g）～90∶1（mL/g）范圍內，多糖提取得率隨著液固比的增大而增加，液固比超過90∶1（mL/g）后，多糖提取率下降。在10 min~20 min范圍內，逐漸增加超聲時間，多糖提取得率緩慢增加，而超過20 min，隨著提取時間延長，粗多糖提取率有所下降。

2.2.3 粗多糖對DPPH自由基清除能力

狗棗獼猴桃葉粗多糖對DPPH自由基的清除能力見圖7。

圖7 多糖對DPPH自由基清除能力Fig.7 DPPH radical scavenging rate of polysaccharides

由圖7可知，狗棗獼猴桃葉多糖對DPPH自由基具有清除作用，且清除能力隨著濃度的增大而增大，但小于VC對DPPH自由基的清除作用。經計算表明，多糖清除DPPH自由基的半數抑制濃度（IC50）為0.43 mg/mL。以上結果表明，狗棗獼猴桃葉粗多糖可以作為一種天然的抗氧化劑。

3 結論

狗棗獼猴桃葉粗多糖的最優超聲波輔助提取工藝為：超聲功率989.61 W，提取時間20.00 min，液固比為80∶1（mL/g）。在此條件下，狗棗獼猴桃葉多糖提取得率理論值為5.59%。修正上述實驗條件為超聲功率為 990 W，提取時間 20.00 min，液固比為 1∶80（mL/g），進行超聲輔助提取多糖，平行測定3次，所得狗棗獼猴桃葉多糖提取率為5.41%，與理論值相差不大。結果表明超聲輔助提取可以顯著提高狗棗獼猴桃葉粗多糖的提取率，具有提取時間短，有效成分的提取率高成本低、低溫保護熱敏性成分、污染小等優點。此外，超聲輔助提取得到的狗棗獼猴桃葉多糖具有清除DPPH自由基的能力，可以作為一種天然的抗氧化劑。

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Optimization of the Ultrasonic-assisted Extraction of Polysaccharide from the Leaves of Actinidia kolomikta Using Response Surface Methodology

LU Juan，CHANG Qing-quan，TAN Li，BAI Xiao-xian，WANG Hai-lian
（College of Chemistry，Changchun Normal University，Changchun 130032，Jilin，China）

The ultrasonic-assisted extraction technology and antioxidant activities of polysaccharide from the leaves ofActinidia kolomikta（Rupr.et Maxim.）Planch were researched in this paper.Taking the yield of crude polysaccharide as the response value，on the basis of single factor experiment，the effect of ultrasonic-assisted extraction factors on polysaccharide were researched.A three-level-three-factor response surface methodology design was employed to optimize the three extraction variables and to determine the optimum technology.And the antioxidant capacity of the polysaccharide was assessed through DPPH radical scavenging test.The experimental results showed that the optimum technology was that the ultrasonic power was 989.61 W，the extraction time was 20 min，the extraction liquid-to-solid ratio was 80 ∶1（mL/g），under the condition the yield of the crude polysaccharide from the leaves ofActinidia kolomiktawas 5.59%.Setting ultrasonic power as 990 W，extraction time as 20 min and liquid-to-solid ratio as 80 ∶1（mL/g）to verify the optimum extraction technology，and the yield of the crude polysaccharide was 5.41%.The polysaccharide extracted from the leaves ofActinidia kolomiktahad effect of scavenging DPPH radical，and the ability of scavenging DPPH radical was proportional to the concentration of polysaccharide.

Actinidia kolomikta；polysaccharide；ultrasonic-assisted extraction；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.014

陸娟（1982—），女（漢），副教授，理學博士，研究方向：生物有機物提純及活性研究。

2017-04-06