響應(yīng)面優(yōu)化超臨界法萃取綠豆皮黃酮工藝

張楊，劉闖

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林132101）

響應(yīng)面優(yōu)化超臨界法萃取綠豆皮黃酮工藝

張楊，劉闖*

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林132101）

采用超臨界CO2技術(shù)萃取綠豆皮中黃酮類物質(zhì)，通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)超臨界萃取綠豆皮黃酮工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：當(dāng)萃取壓力31 MPa、萃取溫度47℃、萃取時(shí)間3.58 h、原料/夾帶劑=1∶0.62（g/mL）時(shí)，綠豆皮黃酮的萃取率最高為87.64%。影響黃酮萃取率由強(qiáng)到弱的因素依次為萃取溫度＞萃取壓力＞萃取時(shí)間＞原料/夾帶劑。

綠豆皮；黃酮；超臨界法；萃取；響應(yīng)面試驗(yàn)

綠豆作為主要的豆類，有著重要的地位作用，還可用于藥物中[1-2]，能夠起到消暑、抗氧化以及利尿的作用。在綠豆中，其含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如綠豆淀粉、綠豆蛋白以及綠豆皮中的黃酮類化合物成分，都具有重要的作用，而主要的是綠豆中活性成分黃酮類物質(zhì)[3]，有研究表明，綠豆中黃酮類化合物能夠抗氧化等功效，作為活性成分主要存在于綠豆皮中。目前，提取綠豆皮中黃酮的方法主要為有機(jī)溶劑法、研究深入的還有微波、超聲波等輔助提取法[4-6]。超臨界CO2萃取技術(shù)是新興起的高新技術(shù)，其特點(diǎn)為節(jié)省人力物力，降低能耗，降低廢水排放、無(wú)污染等[7-8]，在食品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[9-10]。食品行業(yè)發(fā)展迅速，綠豆開(kāi)發(fā)應(yīng)用的產(chǎn)品越來(lái)越多，產(chǎn)生的綠豆皮下腳料也越來(lái)越多，因此開(kāi)發(fā)綠豆皮產(chǎn)品、對(duì)綠豆皮進(jìn)行深加工以及提取綠豆皮功能成分就成為急需解決的問(wèn)題，本試驗(yàn)以綠豆皮為試驗(yàn)材料，利用超臨界CO2萃取綠豆皮黃酮，可對(duì)綠豆皮綜合開(kāi)發(fā)利用提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮綠豆皮干粉：安徽鑫海藥業(yè)有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海康朗生物科技有限公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉：濰坊海之源化工有限公司（以上試劑均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

350 g型中藥粉碎機(jī)：廣州市番禺區(qū)立鶴五金交電商行；UTP-3000型電子分析天平：慈溪紅鉆衡器設(shè)備有限公司；721型可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京華威興業(yè)科技有限公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋：廣州越特科學(xué)儀器有限公司；WE-30型超臨界萃取儀：南通杜欣新能源科技有限公司。

1.3 綠豆皮黃酮提取工藝及測(cè)定方法[11-12]

取一定量綠豆皮，粉碎至160目，稱取粉碎后綠豆皮粉樣品3 kg，通過(guò)超臨界設(shè)備萃取后常壓過(guò)濾，將濾液移至50 mL容量瓶中，進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定方法參照參考文獻(xiàn)[11-12]的方法進(jìn)行。

1.4 超臨界萃取綠豆皮黃酮的單因素試驗(yàn)

1.4.1 萃取壓力對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響

在萃取溫度45℃、萃取時(shí)間3.5 h、原料/夾帶劑為1∶0.6（g/mL）的條件下，以綠豆皮黃酮萃取率為考察指標(biāo)，考核萃取壓力 20、25、30、35、40 MPa 對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響。

1.4.2 萃取溫度對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響

在萃取壓力30 MPa、萃取時(shí)間3.5 h、原料/夾帶劑為1∶0.6（g/mL）的條件下，以綠豆皮黃酮萃取率為考察指標(biāo)，考核萃取溫度 35、40、45、50、55 ℃對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響。

1.4.3 萃取時(shí)間對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響

在萃取壓力30 MPa、萃取溫度45℃、原料/夾帶劑為1∶0.6（g/mL）的條件下，以綠豆皮黃酮萃取率為考察指標(biāo)，考核萃取時(shí)間 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h 對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響。

1.4.4 夾帶劑用量對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響

在萃取壓力30 MPa、萃取溫度45℃、萃取時(shí)間3.5 h的條件下，以綠豆皮黃酮萃取率為考察指標(biāo)，以無(wú)水乙醇為夾帶劑，考核原料/夾帶劑為1∶0.4、1∶0.5、1 ∶0.6、1 ∶0.7、1 ∶0.8（g/mL）對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響。

1.5 綠豆皮黃酮超臨界萃取工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以萃取壓力（A），萃取溫度（B），萃取時(shí)間（C）和原料/夾帶劑（D）作為響應(yīng)因素，以黃酮萃取率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，采用Design-Expert8.0.6軟件及Box-Behnken中心設(shè)計(jì)原理，確定最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in the Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 超臨界萃取綠豆皮黃酮的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 萃取壓力對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響

萃取壓力對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響見(jiàn)圖1。

全球性的氣候問(wèn)題以及極端天氣、自然災(zāi)害的頻繁發(fā)生常常導(dǎo)致我國(guó)部門農(nóng)產(chǎn)品供應(yīng)不足的現(xiàn)象，影響著我國(guó)農(nóng)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。此外，我國(guó)的城市化、工業(yè)化進(jìn)程的不斷深化導(dǎo)致農(nóng)業(yè)耕地的減少也一定程度上影響著農(nóng)產(chǎn)品供應(yīng)。經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、人民生活水平的提高拉動(dòng)了國(guó)內(nèi)市場(chǎng)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的需求。因此，由于國(guó)內(nèi)外投資機(jī)構(gòu)蓄意炒作而導(dǎo)致的農(nóng)產(chǎn)品價(jià)格大幅度提升的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，這一狀況也在一定程度上影響著物價(jià)的持續(xù)走高。對(duì)此，政府必須要加大對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的支持力度，在政策上，經(jīng)濟(jì)上都給予一定程度的扶持，保證我國(guó)市場(chǎng)農(nóng)副產(chǎn)品的充足供應(yīng)。

圖1 萃取壓力對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響Fig.1 Effect of extraction pressure on the extraction rate of flavonoids from mung bean

根據(jù)圖1能夠得出，在萃取壓力為20 MPa～30 MPa范圍內(nèi)，隨著萃取壓力的升高，綠豆皮黃酮萃取率逐漸提高，但當(dāng)萃取壓力由30 MPa升高到35 MPa后，萃取率逐漸下降，當(dāng)萃取壓力為30 MPa時(shí)，綠豆皮黃酮萃取率最高，原因可能是壓力過(guò)大對(duì)黃酮造成了損失[13]。因此，選擇萃取壓力25、30、35 MPa為響應(yīng)面研究水平。

2.1.2 萃取溫度對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響

萃取溫度對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 萃取溫度對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of flavonoids from mung bean

根據(jù)圖2可知，當(dāng)萃取溫度為35℃時(shí)，黃酮萃取率最低，隨著萃取溫度的升高，萃取率先升高后降低，當(dāng)溫度為45℃時(shí)，黃酮萃取率達(dá)到最高，原因可能是，當(dāng)萃取溫度過(guò)低時(shí)，較低的溫度導(dǎo)致黃酮不能夠完全溶出，溫度過(guò)高對(duì)破壞黃酮類化合物。因此，選擇40、45、50℃為響應(yīng)面研究水平。

2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響

萃取時(shí)間對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響見(jiàn)圖3。

根據(jù)圖3可知，當(dāng)萃取時(shí)間較短，為2.5 h時(shí)，萃取率最低，當(dāng)逐漸提高萃取時(shí)間，萃取率明顯升高，當(dāng)萃取時(shí)間達(dá)到3.5 h后，萃取率幾乎不變，這說(shuō)明綠豆皮中黃酮已完全被分離，故再提高萃取時(shí)間，萃取率也不會(huì)上升[14]，因此，選擇萃取時(shí)間為 3.0、3.5、4.0 h 為響應(yīng)面研究水平。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of flavonoids from mung bean

2.1.4 原料/夾帶劑比例對(duì)綠豆皮黃酮萃取率的影響原料/夾帶劑比例對(duì)萃取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 原料/夾帶劑比例對(duì)萃取率的影響Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid on extraction rate

根據(jù)圖4可知，當(dāng)原料/夾帶劑為1∶0.4（g/mL）時(shí)，黃酮萃取率最低，隨著夾帶劑量的增大，萃取率先升高，當(dāng)原料/夾帶劑為 1 ∶0.6（g/mL）時(shí)，萃取率達(dá)到最高，繼續(xù)增加夾帶劑量后，萃取率幾乎不變，原因可能是，當(dāng)夾帶劑過(guò)低時(shí)，較少的夾帶劑導(dǎo)致萃取不徹底，當(dāng)夾帶劑達(dá)到一定量后，黃酮已經(jīng)完全被提出，因此繼續(xù)增大夾帶劑量后萃取率幾乎不變。因此，選擇原料/夾帶劑為 1 ∶0.5、1 ∶0.6、1 ∶0.7（g/mL）為響應(yīng)面研究水平。

2.2 超臨界萃取綠豆皮黃酮工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

采用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)行四因素三水平的RSM（response surface methodology）分析試驗(yàn)。考察萃取壓力（A），萃取溫度（B），萃取時(shí)間（C）和原料/夾帶劑（D）對(duì)黃酮萃取率（Y）的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

應(yīng)用Design-Expert8.0.6軟件將表2做出多元回歸擬合、方差分析及顯著性檢驗(yàn)，能夠得出黃酮萃取率作為目標(biāo)函數(shù)，關(guān)于每個(gè)因素編碼值二次回歸方程如下：

表2 Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Benhnken central composite design arrangement and experimental results

將以上結(jié)果做出顯著性檢驗(yàn)，表3是方差分析結(jié)果，表4是可信度分析結(jié)果。

分析表 3、表 4，能夠得出，此結(jié)果，p＜0.000 1，遠(yuǎn)小于0.01，表明此數(shù)據(jù)分析結(jié)果極顯著，回歸數(shù)學(xué)模型和實(shí)際測(cè)定數(shù)值能夠完全擬合，實(shí)驗(yàn)誤差較小，因此，能夠利用此數(shù)學(xué)回歸方程模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)用它進(jìn)行計(jì)算。R2=98.49%，理論值和實(shí)際測(cè)定的數(shù)值有很高的相關(guān)聯(lián)性，表明此方程較可靠。在回歸模型中，一次項(xiàng) A、B，交互項(xiàng) AC、BC，二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2，均表現(xiàn)出了極顯著水平，交互項(xiàng)BD，一次項(xiàng)C，均表現(xiàn)出了顯著水平。方差分析結(jié)果表明，影響黃酮萃取率由強(qiáng)到弱的因素為萃取溫度＞萃取壓力＞萃取時(shí)間＞原料/夾帶劑。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for fitted quadratic regression equation

表4 回歸模型的可信度分析Table 4 Reliability analysis of the established regression model

2.2.2 交互作用對(duì)黃酮萃取率影響的響應(yīng)面分析

交互作用極顯著因素響應(yīng)面及等高線圖見(jiàn)圖5。

等高線是反應(yīng)因素之間的相互作用的，能夠從圖中直接明顯看出[15-16]。若等高線圖中圓圈是橢圓，代表因素之間作用顯著，若圖是圓形，代表因素之間不顯著。萃取壓力與萃取時(shí)間、萃取溫度與萃取時(shí)間交互情況極顯著，具體表現(xiàn)為等高線中的圖形呈明顯的橢圓形，萃取溫度與原料/夾帶劑交互情況顯著，等高線圖呈現(xiàn)出橢圓，而萃取壓力與萃取溫度、萃取壓力與原料/夾帶劑、萃取時(shí)間與原料/夾帶劑交互情況不顯著，具體表現(xiàn)為等高線圖幾乎呈現(xiàn)為圓形。

圖5 交互作用極顯著因素響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surfaces and contour plots showing the interactive effects

2.2.3 優(yōu)化擠出酶解復(fù)合法液化工藝參數(shù)

為了能夠明確最優(yōu)參數(shù)，要把回歸數(shù)學(xué)方程對(duì)每個(gè)參數(shù)求一階偏導(dǎo)數(shù)，并設(shè)其是0，得到四元一次方程如下：

求解得：A＝0.151、B＝0.327、C＝0.154、D＝0.204，即最佳工藝參數(shù)為萃取壓力30.75MPa、萃取溫度46.63℃、萃取時(shí)間 3.58 h、原料/夾帶劑=1∶0.62（g/mL），在此參數(shù)下，黃酮萃取率是87.32%。為便于實(shí)際操作，將參數(shù)修正為萃取壓力31 MPa、萃取溫度47℃、萃取時(shí)間3.58 h、原料/夾帶劑=1 ∶0.62（g/mL），采用此參數(shù)做 3次平行試驗(yàn)，黃酮萃取率是87.64%，實(shí)際測(cè)定值和理論預(yù)測(cè)值比較相近，表明此模型可優(yōu)化萃取綠豆皮黃酮工藝。

3 結(jié)論

采用超臨界CO2萃取技術(shù)萃取綠豆皮黃酮，通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)超臨界萃取綠豆皮黃酮工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳萃取條件為：萃取壓力31 MPa、萃取溫度 47℃、萃取時(shí)間 3.58 h、原料/夾帶劑 =1∶0.62（g/mL），此條件下綠豆皮黃酮的萃取率為87.64%。方差分析結(jié)果表明，影響黃酮萃取率由強(qiáng)到弱的因素為萃取溫度＞萃取壓力＞萃取時(shí)間＞原料/夾帶劑。

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Supercritical Extraction of Flavonoids from Mung Bean Skin by Response Surface Methodology

ZHANG Yang，LIU Chuang*
（College of Food Engineering，Jilin Agricultural Science and Technology College，Jilin 132101，Jilin，China）

Supercritical CO2extraction was used to extract flavonoids from mung bean hulls.The optimum conditions were as follows：extraction pressure 31 MPa，extraction temperature 47℃，extraction time 3.58 h and the ratio of raw material/entrainer=1 ∶0.62（g/mL）.Under these conditions，the extraction rate of flavonoids was 87.64%.The results of analysis of variance also showed that the factors influencing flavonoid extraction rate from strong to weak were extraction temperature＞ extraction pressure＞ extraction time＞ raw material/entrainer.

mung bean husk；flavonoids；supercritical method；extraction；response surface test

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.012

吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新科研項(xiàng)目（吉農(nóng)院合字[2016]第2016041號(hào)）

張楊（1996—），女（漢），本科在讀，食品科學(xué)與工程專業(yè)。

*通信作者：劉闖，男，本科，研究方向：食品科學(xué)與體育運(yùn)動(dòng)學(xué)。

2017-01-10