橡子粉低聚異麥芽糖功能性實驗分析

張智，李晴，化洪苓，尹文哲，李杰，馬建章，*

（1.東北林業大學，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱150086；3.東北農業大學，黑龍江哈爾濱150030）

橡子粉低聚異麥芽糖功能性實驗分析

張智1，李晴1，化洪苓1，尹文哲2，李杰3，馬建章1，*

（1.東北林業大學，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱150086；3.東北農業大學，黑龍江哈爾濱150030）

初步探究橡子粉低聚異麥芽糖的促雙歧桿菌增殖功能及潤腸通便功效。以橡子粉低聚異麥芽糖取代葡萄糖為碳源添加到雙歧桿菌MRS培養基中，進行增殖實驗及生長曲線的比較；對小鼠建立便秘模型組、空白對照組及低、中、高3個劑量組并進行小鼠排便實驗及小腸推進實驗。結果表明，橡子粉低聚異麥芽糖對青春雙歧桿菌具有良好的體外促增殖作用。隨著橡子粉低聚異麥芽糖添加濃度的增加，活菌數增加。當橡子粉低聚異麥芽糖替代葡萄糖且濃度為1.5%時，培養24 h后，青春雙歧桿菌活菌數為（7.22±0.15）%，達到最大生長量，且使青春雙歧桿菌提前進入穩定生長期；低、中、高劑量的橡子粉低聚異麥芽糖均能改善便秘小鼠潤腸通便的功能，其中，中劑量的橡子粉低聚異麥芽糖效果較好。說明橡子粉低聚異麥芽糖有良好的促雙歧桿菌增殖功能及潤腸通便功效。

橡子粉低聚異麥芽糖；雙歧桿菌；促增殖作用；潤腸通便

橡子（acorn），為麻櫟屬橡樹和常綠櫧栲類橡樹所結果實，我國橡子資源豐富，約有7屬300多種[1]。橡子仁營養豐富，其中含有淀粉約50.6%~58.7%、蛋白質11.7%~15.8%、脂肪 2.1%~2.8%、單寧 10.2%~14.1%[2]。目前利用橡子粉制備低聚異麥芽糖的相關研究尚未發現。

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是一種人體腸道中的益生菌，有著增強營養、延緩衰老、抗腫瘤、抑制內毒素、維持腸道正常菌群平衡，增強機體抵抗力等的特殊功能[3-6]。本文所用的橡子粉低聚異麥芽糖為酶法制備，低聚異麥芽糖的主要成分是異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖，作為功能性低聚糖，是雙歧桿菌的有效增殖因子，能夠使雙歧桿菌大量增殖[7]。關于低聚糖作為益生元對雙歧桿菌的增殖作用已有諸多研究，例如魔芋低聚糖[8]、金絲小棗低聚糖[9]等的相關研究。但關于橡子粉制取的低聚異麥芽糖增殖雙歧桿菌的研究鮮見報道。

由于低聚異麥芽糖可以促進腸道的菌群平衡，因此低聚異麥芽糖有著潤腸通便的功效。目前已有很多關于低聚糖潤腸通便功能的研究，如鄭學玲等[10]通過對小鼠的排便實驗及小腸推進功能實驗研究發現小麥麩皮戊聚糖有顯著的潤腸通便功能，周慧等[11]通過復方地芬諾酯建立小鼠藥物便秘模型組，同時建立麻仁丸陽性對照組、空白對照組，驗證了大米低聚異麥芽糖的潤腸通便功效。

本文以酶法制備的橡子粉低聚異麥芽糖為研究對象，分別對青春雙歧桿菌進行體外促雙歧桿菌增殖實驗，對小鼠進行體內潤腸通便功能實驗，研究分析橡子粉低聚異麥芽糖的促雙歧桿菌增殖功能及其潤腸通便功效，為其應用于食品研究中提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 體外促雙歧桿菌增殖實驗

1.1.1 實驗菌株

青春雙歧桿菌：ATCC，哈爾濱美華有限公司。

1.1.2 材料、儀器及試劑

橡子粉：撫順金宇食品有限公司；酵母粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨：天津天力化學試劑有限公司。

YQX-Ⅱ厭氧培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；SW-CJ-1G單人單面（水平）凈化工作臺：江蘇通凈凈化設備有限公司；ZHWY-2102C恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；PHS-3 pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；722s可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.1.3 培養基

1）脫脂乳培養基：稱取低脂乳12 g，加入100 mL的蒸餾水中，然后在電爐連續煮沸2次～3次去乳皮脫脂，用于菌種的活化，115℃滅菌15 min后冷卻備用；（2）MRS培養基：蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸二銨2 g，吐溫80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，加蒸餾水定容到1 000 mL，滅菌前pH值調至6.2~6.4，置于電爐上加熱溶解，將配好的培養基置于錐形瓶中，121℃滅菌15 min[12]。固體培養基另加入20 g瓊脂。

1.1.4 菌種活化

稱取一定量的青春雙歧桿菌的菌粉溶解于100 mL脫脂乳培養基中，充分混勻，（37±1）℃恒溫靜置培養24 h，然后1%的接種量繼續傳代培養。活化后，傳代3次，于厭氧管中厭氧培養48 h~72 h，挑取菌落形態較大、乳白色、濕潤、周邊圓滑的菌落，相差顯微鏡觀察形態，重復3次，菌落形態一致后，再活化兩次，作為實驗菌株。

1.1.5 平板菌落計數

樣液采用10倍梯度稀釋，選取適當稀釋度傾注平板，使其均勻分布于培養基中，37℃厭氧培養48 h后計數菌落數目。

1.1.6 增殖實驗

以不同劑量橡子粉低聚異麥芽糖代替葡萄糖作為MRS培養基碳源，添加濃度分別為0%、0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%，于（37±1）℃厭氧靜置培養，24 h后取出，測定其活菌數[13]。以葡萄糖為碳源的MRS培養基為對照組，比較不同濃度橡子粉低聚異麥芽糖對青春雙歧桿菌的增殖效果。

1.1.7 生長曲線

通過1.1.6試驗，確定橡子粉低聚異麥芽糖作為碳源在MRS培養基中最適添加比例。按1%接種量，將活化好菌液接種到已滅菌的以橡子粉低聚異麥芽糖為碳源的MRS液體培養基中，靜置培養48 h，每隔4 h從三角瓶中吸取0.1 mL發酵液，采用平板計數法，測定培養基中的活菌數，以葡萄糖基礎培養基為對照，研究橡子粉低聚異麥芽糖對青春雙歧桿菌生長曲線的影響。

1.2 體內潤腸通便功能實驗

1.2.1 實驗動物

選取雄性小鼠90只，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（黑）2013-004，體重19 g~21 g。小鼠按清潔級動物飼養，自由進食，飲潔凈水，保持實驗室環境衛生，溫度18℃～20℃，相對濕度50%～60%，通風良好，分籠喂養。

1.2.2 材料及試劑

生理鹽水（250 mL：2.25 g）：哈爾濱三聯藥業有限公司；復方地芬諾酯片（藥品級）：吉林萬通藥業集團；活性炭粉、阿拉伯樹膠（AR）：天津市致遠科技有限公司。

1.2.3 實驗動物的安排

實驗小鼠分為5組，每組18只，共90只。

A組（空白對照組）：以蒸餾水灌胃；B組（便秘模型對照組）：以復方地芬諾酯灌胃；A組和B組小鼠每天灌胃蒸餾水0.2 mL/只；C、D、E組分別為橡子粉低聚異麥芽糖低、中、高3個劑量組，按體質量計算，劑量組的小鼠每天分別灌胃約0.03、0.3、3.0 g/kg·bw的橡子粉低聚異麥芽糖溶液0.2 mL/只，實驗期間自由進食[14]。

1.2.4 小鼠排便實驗

在連續喂養20 d后，各組取9只小鼠禁食24 h，飲用水正常供應，除空白對照組外，其余各組灌胃復方地酚諾酯50 mg/kg·bw，將小鼠放入籠中單獨喂養，正常飲水進食，1 h后，各劑量組灌胃一次受試物，然后各組小鼠灌胃15%碳黑水作為標記物，觀察記錄每只小鼠自灌胃碳黑水起至首次排出黑便所需時間，以及8 h內排便粒數及排便重量。

1.2.5 小腸推進實驗

連續給予受試物20 d后，各組剩余小鼠禁食24 h，除空白對照組外，其余各組灌胃復方地酚諾酯50 mg/kg·bw，20 min后各組小鼠灌胃15%碳黑水（阿拉伯樹膠與活性炭粉末的質量之比為2∶1）[10]，20 min后用頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管平鋪成直線，測量小腸全長和由幽門至墨水前沿距離，計算小腸推進率，計算公式如下[15-16]：

1.3 橡子粉低聚異麥芽糖的制備

1.4 數據分析

所有進行實驗均平行3次，數據表示為：結果±標準差，分析軟件為SPSS 17.0。

2 結果與討論

2.1 體外促雙歧桿菌增殖實驗

2.1.1 增殖實驗

不同濃度橡子粉低聚異麥芽糖濃度對青春雙歧桿菌體外增殖的影響見圖1。

圖1 不同濃度橡子粉低聚異麥芽糖濃度對青春雙歧桿菌體外增殖的影響Fig.1 Effect of different level of acorn starch isomalto-oligosaccharide on the viable count of Bifidobacterium adolescentis in vitro

由圖1可以看出，橡子粉低聚異麥芽糖的濃度在培養基中為1.50%時，培養24 h后，與對照組呈顯著性差異（p＜0.05）。這說明橡子粉低聚異麥芽糖作為碳源對雙歧桿菌進行增殖的能力優于葡萄糖。

但是，橡子粉低聚異麥芽糖濃度增加到2%時，雙歧桿菌的生長沒有呈現繼續增加的趨勢，可能是低聚異麥芽糖濃度進一步提高導致滲透壓增加，對其有一定脫水作用，抑制了雙歧桿菌的進一步生長增殖，說明橡子粉低聚異麥芽糖對益生菌的促生長作用表現在一定的濃度范圍以內。

2.1.2 生長曲線

青春雙歧桿菌生長曲線見圖2。

圖2 青春雙歧桿菌生長曲線（不同碳源）Fig.2 The growth curve of Bifidobacterium adolescentis（different carbon source）

選用1.5%濃度的橡子粉低聚異麥芽糖比較生長曲線。由圖2可以看出，橡子粉低聚異麥芽糖對青春雙歧桿菌的增殖效果優于葡萄糖對照組。培養的前8 h，橡子粉低聚異麥芽糖組和葡萄糖對照組中，活菌數都沒有明顯的提高；培養8 h后，兩種培養基中雙歧桿菌的活菌數都開始有明顯的增長趨勢，且橡子粉低聚異麥芽糖組培養基中活菌數比葡萄糖組同時間的活菌數高，且都是在36 h后開始進入衰亡期。以橡子粉低聚異麥芽糖為碳源培養的雙歧桿菌均比對照組生長速率快，最大生長速率提高（6.59±0.13）%。

2.2 體內潤腸通便功能實驗

2.2.1 小鼠排便實驗

2.2.1.1 各組小鼠灌胃前后體重變化

各組小鼠灌胃前后體重變化結果見表1。

表1 各組小鼠灌胃前后體重變化結果（±s，n=9）Table 1 Weight changes of mice in each group before and after intragastric administration（±s，n=9）g

表1 各組小鼠灌胃前后體重變化結果（±s，n=9）Table 1 Weight changes of mice in each group before and after intragastric administration（±s，n=9）g

注：△表示與0 d相比，差異性顯著（p＜0.05）；△△表示與0 d相比，差異性極顯著（p＜0.01）。

組別 0 d 10 d 20 d空白對照組 20.26±0.63 22.74±1.48 26.11±1.55△便秘模型組 20.45±0.51 23.02±1.72△ 26.97±0.46△△低劑量組 19.86±1.16 22.32±0.64△ 25.24±0.71△△中劑量組 19.91±1.84 22.43±1.53 26.13±1.37△△高劑量組 20.27±1.57 22.75±0.67 27.00±1.62△

由表1可以看出，空白對照組、高劑量組小鼠灌胃20 d時，體重變化有顯著性差異（p＜0.05）；便秘模型組、低劑量組小鼠灌胃10 d時體重有顯著性差異（p＜0.05）；而到20 d時，便秘模型組、低劑量組、中劑量組小鼠體重相較于0 d都有極顯著性差異（p＜0.01）；且相對于空白對照組其他各組同一時間的小鼠體重并無顯著性差異，這說明橡子粉低聚異麥芽糖的灌胃對小鼠體重并無直接影響。

2.2.1.2 各組實驗小鼠排首粒黑便時間、8 h內排便粒數和排便質量

各組實驗小鼠排首粒黑便時間、8 h內排便粒數和排便質量見表2。

由表2可以看出，各劑量組與空白組組比較均具有極顯著性差異（p＜0.01），與便秘模型組相比較均有顯著性差異，其中低劑量組排首粒黑便時間表現為顯著性差異（p＜0.05），除此之外均變現為極顯著性差異（p＜0.01），這說明低、中、高劑量的橡子粉低聚異麥芽糖均能非常明顯的增加8 h內排便粒數；與便秘模型組相比，低、中、高劑量組均能非常明顯增加便秘小鼠的排便質量；與便秘模型組相比，低、中、高劑量組均能非常明顯增加8 h內小鼠的排便粒數；與便秘模型組相比，低劑量組也能明顯縮短排首粒黑便時間。并且各檢測指標的空白對照組與便秘模型組均為極顯著性差異（p＜0.01），表明模型建立成功。

表2 各組實驗小鼠排首粒黑便時間、8 h內排便粒數和排便質量Table 2 The first black stool excreted time，the number of feces in 8 h and the mass of defecation of mice in each group（±s，n=9）

表2 各組實驗小鼠排首粒黑便時間、8 h內排便粒數和排便質量Table 2 The first black stool excreted time，the number of feces in 8 h and the mass of defecation of mice in each group（±s，n=9）

注：△△表示與空白組相比，差異性極顯著（p＜0.01）；*表示與便秘模型組相比，差異性顯著（p＜0.05）；**表示與便秘模型組相比，差異性極顯著（p＜0.01）。

排便質量/g空白對照組 122.5±10.5** 28.52±1.53** 0.322 8±0.013 4**便秘模型組 193.3±5.2△△ 16.31±1.22△△ 0.204 4±0.012 2△△低劑量組 165.8±13.1△△* 21.83±1.19△△** 0.262 1±0.009 7△△**中劑量組 150.4±10.6△△** 24.45±2.03△△** 0.290 1±0.010 3△△**高劑量組 161.3±12.2△△** 23.11±1.29△△** 0.278 9±0.008 9△△**組別 排首粒黑便時間/min 8 h內排便粒數

同時，從表中數據可以看出，各劑量組實驗小鼠排首粒黑便時間均比空白組長，平均延長36.67 min，但比模型組所耗時間平均縮短34.13 min，其中中劑量組效果最為明顯；各劑量組8 h內排便粒數雖比空白組略少，但平均比模型組多出6.82粒，其中中劑量組最多；以各劑量組的排便質量來看，略低于空白組，比模型組平均多0.073 g，其中依然是中劑量組效果最為理想。因此，橡子粉低聚異麥芽糖有利于小鼠排便，且中劑量的橡子粉低聚糖效果最好。

2.2.2 小腸推進實驗

各實驗組小鼠的墨汁推進率見表3。

表3 各實驗組小鼠的墨汁推進率（±s，n=9）Table 3 Ink advance rate of mice in each group（±s，n=9）

表3 各實驗組小鼠的墨汁推進率（±s，n=9）Table 3 Ink advance rate of mice in each group（±s，n=9）

注：△△表示與空白組相比，差異性極顯著（p＜0.01）；*表示與便秘模型組相比，差異性顯著（p＜0.05）；**表示與便秘模型組相比，差異性極顯著（p＜0.01）。

組別 小腸全長/cm 墨汁推進長度/cm 墨汁推進率/%空白對照組 55.76±5.55 46.09±5.23 82.65±4.98**便秘模型組 62.5±7.29 33.29±6.22 53.26±5.84△△低劑量組 65.03±3.88 38.91±4.19 59.83±5.66△△中劑量組 57.55±7.04 39.30±7.03 68.28±7.02△△**高劑量組 59.73±8.25 37.89±5.29 63.44±3.42△△*

由表3可以看出，便秘模型組與空白對照組小鼠小腸墨汁推進率有極顯著性差異（p＜0.01），表明便秘模型建立成功；中、高劑量組與模型組小鼠小腸墨汁推進率，均有顯著性差異（p＜0.05），表明中、高劑量的橡子粉低聚異麥芽糖具有促進便秘小鼠小腸墨汁推進率的作用；低、中、高3個劑量組和模型組與空白組小鼠的小腸墨汁推進率均有極顯著性差異（p＜0.01），表明低、中、高劑量的橡子粉低聚異麥芽糖均具有促進便秘小鼠小腸墨汁推進率的作用，但效果不明顯；低、中、高3個劑量組小鼠的小腸墨汁推進率，兩兩之間均無顯著性差異，但其中中劑量組與模型組差異顯著性最為明顯（P=0.08），表明中劑量的橡子粉低聚異麥芽糖對促進便秘小鼠小腸墨汁推進率的效果更好。

3 結論

1）以橡子粉低聚異麥芽糖替代葡萄糖為碳源添加到青春雙歧桿菌MRS培養基中，發現橡子粉低聚異麥芽糖對青春雙歧桿菌具有良好的體外促增殖作用。隨著橡子粉低聚異麥芽糖添加濃度的增加，活菌數增加。當橡子粉低聚異麥芽糖替代葡萄糖且濃度為1.5%時，培養24 h后，青春雙歧桿菌活菌數為（7.22±0.15）%，達到最大生長量。

以1.5%濃度的橡子粉低聚異麥芽糖為碳源的培養基相較于以葡萄糖為碳源的培養基可促使青春雙歧桿菌的生長提前進入穩定生長期，總體看來提高了青春雙歧桿菌的生長速率，最大生長速率提高了（6.59±0.13）%。

2）選取 SPF 級雄性小鼠（19 g～21 g）為實驗對象，采用復方地芬諾酯建立了小鼠藥物便秘模型組，通過灌胃不同濃度的橡子粉低聚異麥芽糖建立低、中、高劑量組，以此研究對便秘小鼠潤腸通便的效果。

小鼠排便實驗及小腸推進實驗的結果表明，低、中、高劑量的橡子粉低聚異麥芽糖均能改善便秘小鼠潤腸通便的功能，其中，中劑量的橡子粉低聚異麥芽糖效果較好，說明橡子粉低聚異麥芽糖是很好的潤腸通便保健食材，且長期攝入一定量的橡子粉低聚異麥芽糖能達到緩解便秘的效果。

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The Analysis Study on Acorn Starch Isomalto-oligosaccharide Functionality

ZHANG Zhi1，LI Qing1，HUA Hong-ling1，YIN Wen-zhe2，LI Jie3，MA Jian-zhang1，*
（1.Northeast Forestry University，Harbin 150040，Heilongjiang，China；2.Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086，Heilongjiang，China；3.Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

The effect of acorn starch isomalto-oligosaccharide on the proliferation ofBifidobacteriumand its laxative effect was explored.Being used as carbon source substitute for glucose in MRS medium，the proliferation test and the comparison of growth curves were done；the constipation model group，blank control group，acorn starch isomalto-oligosaccharide low，medium，and high dose groups were established with mice，at the same time，the experiment of mice defecation and intestinal propulsion were done.Text results showed that the acorn starch isomalto-oligosaccharide had significant promoting effects on the growth ofBifidobacterium adolescentis.With the increase of acorn starch isomalto-oligosaccharide，the viable count of the probiotics increased.When glucose was substituted by the acorn starch isomalto-oligosaccharide with concentration 1.5%，after 24 h culture，the count of theBifidobacterium adolescentiswas（7.22±0.15）%，which had reach to maximum quantity，and acorn starch isomalto-oligosaccharide promoted the growth rates of theBifidobacterium adolescentisand made its stable growth periods earlier.The acorn starch isomalto-oligosaccharide low，medium，and high dose groups all could improve the function of constipation and defecation，in which，the laxative effect of medium dose group was better.The result showed that the acorn starch isomalto-oligosaccharide had good function of promoting the proliferation ofBifidobacteriumand the laxative effect.

acorn starch isomalto-oligosaccharide；Bifidobacterium；growth-promoting effects；laxative

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.006

大熊貓益生菌制劑的研究（SG1409）；黑龍江省應用技術研究與開發計劃項目（GA15B203）

張智（1964—），女（漢），教授，博士，研究方向：微生物與發酵工程。

*通信作者：馬建章（1937—），男（漢），院士，研究方向：野生動物生態與管理。

2017-03-30