高效液相色譜法同時測定不同來源水翁花中的2種活性成分

邱宏聰 陳 昭 柴 玲 劉布鳴

(1 廣西中藥質量標準研究重點實驗室(廣西中醫藥研究院)，南寧，530001； 2 廣東省第二中醫院(廣東省中醫藥工程技術研究院)，廣州，510095； 3 廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣州，510095)

高效液相色譜法同時測定不同來源水翁花中的2種活性成分

邱宏聰1陳 昭2,3柴 玲1劉布鳴1

(1 廣西中藥質量標準研究重點實驗室(廣西中醫藥研究院)，南寧，530001； 2 廣東省第二中醫院(廣東省中醫藥工程技術研究院)，廣州，510095； 3 廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣州，510095)

目的：對水翁花中的熊果苷和2′,4′-二羥基-6′-甲氧基-3′-5′-二甲基查耳酮進行含量測定研究，建立藥材的質量標準。方法：采用高效液相色譜(HPLC)法：以Diamonsil-C18(5 μm，250×4.6 mm)為色譜柱，以乙腈-0.05%磷酸(60:40)為流動相進行梯度洗脫，檢測波長254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃；結果：采用HPLC法建立了8批藥材的指標性成分指紋圖譜并進行準確定量；結論：該方法快速、高效、準確，能夠全面、有針對性地對水翁花藥材的質量優劣進行評價。

水翁花；高效液相色譜法；活性成分

水翁花(FlosCleistocalycisOperculati)為桃金娘科植物水翁(Cleistocalyxoperculatus(Roxb.)Merr.Et Perry)的花蕾，始載于《嶺南采藥錄》，為《廣東省中藥材標準》(第一冊)收載品種[1]。主分布于廣東、海南、廣西、福建等省區。具有清熱解暑、生津止渴、去濕消滯之功效，用于夏天暑濕食滯所致的發熱、咽干、口渴腹脹或嘔吐泄瀉[1-2]。常作為夏季消渴解暑的中藥復方“清熱涼茶”的主要原料之一，在民間使用非常廣泛。是嶺南地區的代表藥之一。

迄今為止，對于水翁花的相關研究中，除有成分提取分離。陳建等[2]利用水蒸汽蒸餾(SDE)和超臨界CO2萃取技術(SFE)提取水翁花的揮發油。Chun-Lin Ye等[3]運用氣相色譜以及氣質聯合色譜等分析技術從水翁花中提取分離5種黃酮類化合物。還有藥理學方面的研究，除了傳統的清熱解暑的療效外，水翁花還具有其他藥理活性。羅清等[4]通過研究表明，水翁花具有鎮痛，抗內毒素的作用；程少璋等[5]的研究證實，其具有抗炎鎮痛解熱的作用；葉春林[6]等通過研究表明，水翁花中的成分2′,4′-二羥基-6′-甲氧基-3′-5′-二甲基查耳酮(2′,4-Dihydroxy-3-Methoxychalcone，DMC)能夠誘導肝癌細胞SMMC-7721凋亡，為水翁花在抗腫瘤方向提供了一定的試驗和理論基礎[7]。熊果苷則具有抗菌、鎮咳、平喘、祛痰、抗氧化、利尿、抗潰瘍、抗腫瘤、抑制胰島素降解、增強免疫等作用[8-11]。根據預實驗結果和文獻報道，上述2種成分在水翁花中有較高的含量，因此可以作為控制該藥材質量的指標性成分。但是有關水翁花的藥理作用仍停留在其傳統功效“清熱解暑”，并未得到很好的利用。除提取分離與含量測定外，對水翁花中所含化學成分也無相關深入性的研究報道[12]。羅清[13]雖然對水翁花所含的活性成分進行了大致的分離和鑒定，但仍未對這些化合物中與療效關系最為密切的化合物進行篩選和確定，與此同時，也沒有以此為基礎形成與現有技術條件相適宜的質量標準。綜上所述，選取熊果苷和DMC作為水翁花質量標準的指標性成分，能夠更為貼近其功效主治，并準確反應其內在的質量信息。

本文對水翁花的主要有效成分進行提取分離及對其質量標準進行研究，通過運用柱色譜、薄層色譜、高效液相色譜等現代化分離分析技術，尋找并準確測定相關的活性化合物。同時，根據現有文獻報道的各類活性成分提取工藝[13,15-17]，結合其所含化合物理化性質，完善相關化合物的提取工藝并最終形成質量標準。建立全面、實用、專屬性強、能夠反映水翁花質量控制標準，使其得到更多的使用和發展，進一步促進地方特色藥材與常見病治療藥材的資源保護和可持續利用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Waterse2695-2489);色譜柱Diamonsil-C18(5 μm，250×4.6 mm)；旋轉蒸發器(RE-52AA)；MilliPore Advantage A10自動純水機；Mettler XS205DU電子分析天平;ADAM CB101天平(1 000 g×0.1 g)；CAMAG ATS4型薄層自動點樣儀；CAMAG REPROSTAR3薄層色譜自動成像系統；HH系列數顯恒溫水浴鍋；電DHG-9203A熱恒溫古風干燥箱；KQ-700DE超聲波清洗器。

1.2 試藥和試劑 熊果苷對照品(批號：110742-200314)、2′,4′-二羥基-6′-甲氧基-3′-5′-二甲基查耳酮(DMC)單體為自制、D101-大孔樹脂，由廣東省中醫藥工程技術研究院提供。提取和液相色譜所使用的水均為MilliPore超純水，其他試劑均屬于(廣州化學制劑廠)分析純。流動相磷酸(Fisher)、甲醇(Merck)、乙腈(Merck)等為色譜純。

1.3 分析樣品 水翁花藥材(產地批號見表1)共8批，均購于廣州市中芝源中藥有限公司，經廣西中醫藥研究院賴茂祥研究員鑒定為桃金娘科植物水翁。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 以Diamonsil-C18(5 μm，250×4.6 mm為色譜柱，以乙腈(B)-0.05%磷酸(D)為流動相,采用梯度洗脫，梯度程序為0～10 min，10%B：90%D；10～20 min，30% B:70%D；20～50 min，60% B:40%D；50～60 min，10%B:90%D。所檢測波長254 nm；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；所有樣品進樣量均為10 μL。對照品色譜圖見圖1。

圖1 熊果酸和DMC對照品色譜圖

注：1為熊果酸，2為DMC，含量均為20 μg/mL

2.2 對照品溶液的制備 分別取熊果酸對照品、DMC對照品各10 mg，精密稱定，置同一10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得含2種化合物均為1 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品3 g，加入70%甲醇75 mL，室溫下靜置提取1 d。過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關系考察 精密吸取2.3項下2種對照品溶液適量，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別配制成5、10、20、50、100 μg/mL的溶液。分別精密吸取上述溶液10 μL進樣，記錄各濃度點色譜峰峰面積積分值，結果如表3、表4所示。以對照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標X，峰面積積分值為縱坐標Y，繪制標準曲線，如圖6、圖7，回歸方程為：熊果酸：Y=22 045X-27 676，r2=0.999 3；DMC：Y=10 018X +2 656.5 r2=0.999 1。2種對照品溶液濃度在5～100 μg/mL范圍內線性良好。能夠對水翁花藥材中的2個目標化合物進行準確定量。

2.5 精密度和準確度 精密吸取同一批號藥材供試品溶液10 μL，照4.1項下色譜條件連續進樣6次，記錄熊果酸、DMC峰面積積分值，并計算回收率和RSD。結果顯示，方法準確度和精密度良好。

表1 準確度和精密度試驗結果(n=6)

2.6 重復性試驗 稱取同一批號的樣品(批號：141001—5)6份，按2.2項供試品溶液的制備方法處理，分別進樣10 μL，測定峰面積并計算RSD。結果顯示，熊果酸和DMC的RSD分別為1.5%和1.3%，表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收實驗 取同一批已知含量的藥材樣品(批號：141001—4)3 g，精密稱定5份，按照2.2項供試品溶液的制備方法進行處理，精密吸取續濾液5 mL，再精密加入100 μg/mL對照品溶液1 mL，用甲醇稀釋至刻度。精密吸取上述溶液10 μL，進HPLC，照4.2項下色譜條件分析，測定峰面積，計算含量及回收率，結果顯示(表2，表3)，方法回收率良好，能夠對水翁花中的熊果酸和DMC進行準確定量。

表2 熊果酸加樣回收實驗結果(n=3)

表3 DMC加樣回收實驗結果

2.8 樣品含量測定結果 取不同產地，批次的水翁花藥材，共8批(表4)，按照4.2項下供試品溶液制備方法處理，得供試品溶液，分別精密吸取上述供試品溶液10 μL，注入HPLC，按2.4項下色譜條件進行分析，記錄熊果酸和DMC峰面積并計算含量。含量測定結果見表4，8批藥材的HPLC指紋圖見圖2。

表4 不同產地、批次水翁花含量測定給結果

圖2 8批藥材供試品色譜圖

3 討論

3.1 提取分離條件的考察和優化 為確保水翁花的目標化合物成分能在指紋圖譜中體現，本文根據其理化性質以及查閱文獻[15-16]，分別采用了70%甲醇、乙醇、水等溶劑對其進行提取。最后選用70%甲醇作為溶劑，再利用柱色譜的原理，將提取液用不同比例的甲醇-水溶液進行洗脫，分離有效成分，進行測定，可知其提取液中目標化合物提取率較高，色譜峰信息較豐富。

3.2 HPLC指紋圖譜的建立和優化 本課題根據文獻調研結果發現，水翁花中所含活性成分多為黃酮類，結合預實驗結果，我們發現，有機相采用乙腈時，較甲醇分離效果更佳，且出峰時間較短，故選用；在水相選擇方面，研究發現，向水相中加入一定濃度的磷酸能夠有助于改善峰型，提高分離度，但磷酸濃度過高易對色譜柱產生損傷，因此，經過反復試驗，將磷酸濃度固定在0.5%(v/v)。

洗脫程序選擇方面，鑒于水翁花中所含活性成分較多，且結構較為類似，單純的等度洗脫很難將待測物與其他干擾性成分成功區分，因此選擇梯度洗脫。經反復試驗，2.4項下所述的色譜條件能夠成功區分待測物與其他干擾性成分，故選用。

3.3 不同產地、批次藥材指紋圖譜及質量信息研究 由2.5項下各不同批次、產地藥材中熊果酸和DMC的測定結果可知，廣東產水翁花藥材中上述成分含量最高，海南產藥材中上述成分含量最低。提示水翁花可能受種植地氣候、土壤、地理環境等因素的影響，造成上述差異，在后續的規范化種植及藥材選用中，應謹慎選擇產地，確保藥材質量。

3.4 結論 本研究采用柱層析和HPLC法，對水翁花中的活性成分進行了分離和測定，該方法快速、高效，能夠較為準確全面地反映水翁花中活性成分的含量信息，并用于對不同來源、產地和采收時節的藥材質量進行評價。

[1]廣東省食品藥品監督管理局.中藥材標準(第一冊)[S].廣東科技出版社，2004:62-63.

[2]胡晨霞.廣東習用清熱類藥材的研究概況[J].現代食品與藥品雜志,2007，17(5):25-27.

[3]陳健,姜建國,鄭艾初,水翁花揮發油提取工藝研究[J].食品科學,2006，27(10):409-411.

[4]Chun-LinYe,Yan-HuaLu,Dong-ZhiWei.Flavonoids from Cleistocalyxoperculatus[J].Phytochemistry,2004，65(4):445.

[5]羅清,梅全喜,范文昌,水翁花的鎮痛和抗內毒素研究[J].中華中醫藥學刊,2011，29(7):1569-1570.

[6]程少璋,羅清,高玉橋,水翁花抗炎鎮痛解熱作用研究[J].時珍國醫國藥,2013，24(2):375-376.

[7]葉春林,賴依峰,劉宣淦,等.水翁花黃酮DMC誘導肝癌細胞SMMC-7721凋亡的機制研究[J].2014，39(15):2942-2945.

[8]唐婕妤,彭菲.熊果苷的藥理作用與資源獲取途徑研究進展[J].今日藥學,2015，25(9):673-677.

[9]陸彬,樓鴛鴦,陳楚楚,等.熊果苷抑制斑馬魚胚胎黑色素合成的研究[J].湖南科技大學學報：自然科學版，2015，1：116-120.

[10]李麗梅,趙哲,何近剛,等.不同品種梨果實酚類物質和抗氧化性能分析[J].食品科學,2014，35(17):83-88.

[11]Lee HJ，Kim KW.Anti-inflammatory effects of arbutin in lipopolysaccharide-stimulated BV2 microglial cells[J].Inflamm Res.2012，61(8)：817-825.

[12]孟小斌,曲彩紅.HPLC法測定熊果背乳膏中熊果背的含量[J].中國藥房,2013，24(31):2944-2946.

[13]羅清,梅全喜,廣東省地產藥材水翁花的研究概述[J].亞太傳統醫藥,2009，5(2):130-132.

[14]李曉嬌,劉憶明.α-熊果苷合成研究進展[J].保山學院學報,2014，34(2):18-21.

[15]梅全喜,范文昌,曾聰彥.論廣東地產藥材的研究與開發[J].今日藥學,2009，19(2):14.

[16]木合塔爾·吐爾洪,買買提·吐爾遜,熱薩萊提·伊敏.RP-HPLC法同時測定昆侖雪菊中綠原酸、蘆丁、槲皮素和木犀草素的量[J].中草藥,2016，47(9),1601-1604.

[17]張志榮,吳文輝,陶周超.吳興鐵線蓮總黃酮的提取及體外抗腫瘤活性研究[J].中國現代應用藥學,2016，33(7):879-883.

SimultaneousDeterminationofTwoActiveComponentsinFlosCleistocalycisOperculatibyHighPerformanceLiquidChromatography

Qiu Hongcong1, Chen Zhao2,3,Chai Ling1, Liu Buming1

(1GuangxiKeyLaboratoryofTCMQualityStandards(GuangxiInstituteofChineseMedicineandPharmaceuticalScience),Nanning530001,China; 2GuangdongSecondTCMHospital(GuangdongProvincialEngineeringTechnologyResearchInstituteofTCM),Guangzhou510095,China; 3GuangdongProvincialKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentinTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510095,China)

Objective:To evaluate the quality of Flos Cleistocalycis Operculati by quantitatively determining arbutin and 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′-5′-dimethylchalcone.MethodsHPLC was used for determination, with Diamonsil-C18(5 μm,250×4.6 mm) column and a mobile phase containing acetonitrile-0.05% phosphoric acid; the detection wavelength was 254 nm, column temperature 25 ℃ and the elution mode was gradient, with a flow rate of 1.0 mL/min;ResultsEight batches of herb samples were accurately determined and established fingerprints.ConclusionThe proposed method was fast, efficient and accurate, which can be used in quality evaluation of Flos Cleistocalycis Operculati comprehensively and specifically.

Flos Cleistocalycis Operculati; High performance liquid chromatography; Active components

廣西中醫藥研究院系統研究課題(桂中重自201401)

邱宏聰(1983.11—)，男，碩士，助理研究員，研究方向：中藥和藥物分析及質量標準研究工作,E-mail：364374130@qq.com

劉布鳴(1953.06—)，男，本科，研究員，研究方向：有機、天然產物化學成分以及新藥開發與質量標準研究，E-mail：zybzzdsys@163.com

R286

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.050

(2016-08-01收稿 責任編輯：徐穎)