九里香葉對去卵巢大鼠體積骨密度、血鈣、血磷、堿性磷酸酶、骨組織形態學的影響

文 娛 李曉暉 尤文質 鄭啟忠 高 海 張秋萍 彭清華

(1 廈門市中醫院藥學部，廈門，361009； 2 廈門市中醫GC辦公室，廈門，361009； 3 廈門市中醫院病理科，廈門，361009； 4 廈門市中醫院科教科，廈門，361009)

九里香葉對去卵巢大鼠體積骨密度、血鈣、血磷、堿性磷酸酶、骨組織形態學的影響

文 娛1李曉暉2尤文質1鄭啟忠3高 海4張秋萍2彭清華1

(1 廈門市中醫院藥學部，廈門，361009； 2 廈門市中醫GC辦公室，廈門，361009； 3 廈門市中醫院病理科，廈門，361009； 4 廈門市中醫院科教科，廈門，361009)

目的：觀察九里香葉對去卵巢大鼠體積骨密度、血鈣、血磷、堿性磷酸酶、骨組織形態學的影響。方法：取60只SPF級SD雌性大鼠，通過切除雙側卵巢復制骨質疏松模型。術后7 d分組給藥。模型組：生理鹽水(0.4 mg/kg·d)；對照組：生理鹽水(0.4 mg/kg·d)；戊酸雌二醇組：0.4 m g/kg·d；九里香高劑量組：200 mg/kg·d；九里香中劑量組：100 mg/kg·d；九里香低劑量組：50 mg/kg·d。連續給藥90 d。給藥結束后，測定大鼠體積骨密度，采用電極法測定血鈣；速率法測定血磷、堿性磷酸酶。大鼠右側股骨HE染色，計量骨小梁平均寬度、骨小梁面積百分率。結果：與對照組比較，模型組大鼠體積骨密度明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組大鼠血鈣、堿性磷酸酶明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，血磷無差異；模型組大鼠骨小梁平均寬度及骨小梁面積百分率明顯降低，差異有統計學意義。與模型組比較，九里香葉高劑量組大鼠體積骨密度明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)；九里香葉高劑量組大鼠血鈣明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)，血磷無統計學意義；九里香葉低劑量組大鼠堿性磷酸酶明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；九里香葉高劑量組骨小梁平均寬度及骨小梁面積百分率明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)。結論：九里香葉影響去卵巢大鼠骨質疏松體積骨密度、血鈣、堿性磷酸酶、骨小梁平均寬度及骨小梁面積百分率變化，具有抗骨質疏松作用。

九里香；骨密度；血鈣；血磷；堿性磷酸酶；骨組織形態學

九里香為蕓香科九里香屬植物，主要分布在我國福建、廣東、廣西、海南、臺灣等省區，全年均可采收，其氣香，味苦、辛，有麻舌感[1]。早在多年前，我國南方地區就已經將九里香作為一種民間用藥，其療效得到廣泛認可[2]。它具有行氣活血、散瘀止痛、解毒消腫等功效[3]。實驗證實，黃酮是九里香的主要活性成分之一，尤以葉子中的含量最高[4]，九里香葉作為藥用部位合理[5]。研究證實，黃酮類化合物具有明確的抗骨質疏松作用[6]。九里香葉天然存在的生物黃酮分子量小，能被人體迅速吸收。因此本課題通過切除SD大鼠雙側卵巢復制骨質疏松模型，觀察九里香葉對去卵巢大鼠體積骨密度、血鈣、血磷、堿性磷酸酶、骨組織形態學的影響，從而明確九里香葉是否具有抗骨質疏松作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠，2月齡，體重(250±20)g，SPF級實驗動物，由廈門大學實驗動物中心提供，合格證號SYXK(閩)2013-0006。

1.1.2 藥物 戊酸雌二醇片：拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司分包裝，批號：203A2，規格：1 mg×21片；九里香葉由廈門市中醫院制劑室主任尤文質副主任中藥師鑒定。

1.1.3 試劑與儀器 堿性磷酸酶檢測試劑:美國貝克曼庫爾特有限公司，批號：Z510231，規格：2×400T；磷(PHOSm)檢測試劑：美國貝克曼庫爾特有限公司，批號：Z509208，規格：R1：2×200 mL，R2：2×1 800 mL；電子天平：HXW-Ⅱ(恒恊電子有限公司)；全自動生化分析系統：unicel dxc800(美國貝克曼庫爾特有限公司)；半自動石蠟切片機：RM2245(德國萊卡儀器公司)；生物顯微鏡：BX43(奧林巴斯有限公司)；BI-2000醫學圖像分析系統：成都泰盟有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 取SPF級SD雌性大鼠(2月齡)60只，大鼠予以2%戊巴比妥鈉(0.0002 mL/g)腹腔注射麻醉，術前腹腔注射青霉素(5萬U/kg)，預防感染。無菌條件下摘除雙側卵巢，關閉腹腔，對照組動物同法切除卵巢旁同樣大小的脂肪組織。造模7 d后，分組及給藥。實驗動物隨機分為6個組，各組均為10只動物。

1.2.2 給藥方法 灌胃給藥，1次/d，連續90 d。模型組(OVX)：生理鹽水(0.4 mg/kg·d)；對照組：生理鹽水(0.4 mg/kg·d)；戊酸雌二醇組：0.4 mg/kg·d，(戊酸雌二醇用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液配制成40 mg/L的混懸液)；九里香高劑量組：200 mg/kg·d；九里香中劑量組：100 mg/kg·d；九里香低劑量組：50 mg/kg·d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 體積骨密度測定 實體股骨標本及其不同骨段骨密度值測量：以電子天平測量實體股骨標本及其不同骨段的重量，以“溢出法“測量股骨及其不同骨段的體積。

1.2.3.2 血鈣、血磷、堿性磷酸酶的測定 末次給藥后次日，斷頭取血5 mL置入無抗凝劑的試管中。3 000 r/min，離心15 min，分離血清。采用電極法測定血鈣，速率法測定血磷、堿性磷酸酶。

1.2.3.3 骨組織形態學觀察 取約1.5 cm長，含股骨頭的右側股骨浸于10%中性福爾馬林中固定，PBS液充分漂洗，再經過10%EDTA、PBS(PH 7.4)4 ℃下脫鈣3～4周，隔天換液1次；脫鈣完成，蒸餾水沖洗，70%，80%，90%，95%，無水乙醇梯度脫水各4 h；二甲苯透明12 h，浸透液浸透，石蠟包埋，縱向連續切片，厚4 μm。每個標本取一張切片進行HE染色，作組織學檢查。光鏡下觀察骨組織病理學改變，用BI-2000醫學圖像分析系統進行骨組織形態學分析，每個標本隨機選取5個視野，取其均值，計量：1)骨小梁平均寬度；2)骨小梁面積百分率(%)=骨小梁面積/總組織面積×100%。

2 結果

2.1 九里香葉對去卵巢大鼠體積骨密度的影響 與對照組比較，模型組大鼠體積骨密度明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，戊酸雌二醇組、九里香葉高劑量組大鼠體積骨密度明顯增高，差異有統計學意義，P<0.05。見表1。

2.2 九里香葉對去卵巢大鼠血鈣、血磷、堿性磷酸酶的影響 與對照組比較，模型組大鼠血鈣、堿性磷酸酶明顯降低，差異有統計學意義，P<0.05。與模型組比較，九里香葉高劑量組大鼠血鈣明顯增高，差異有統計學意義，P<0.05；與模型組比較，九里香葉低劑量組大鼠堿性磷酸酶明顯降低，差異有統計學意義，P<0.05。見表2。

表1 九里香葉對大鼠體積骨密度的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，▲P<0.01，與模型組比較△P<0.05

表2 九里香葉對大鼠血鈣、血磷、堿性磷酸酶的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，▲P<0.01，與模型組比較△P<0.05

2.3 九里香葉對去卵巢大鼠骨組織形態學的影響

2.3.1 光鏡下觀察骨小梁 對照組：骨小梁密集、排列整齊、結構呈網狀、連接緊密、骨髓腔較小；模型組：骨小梁稀疏、斷裂、排列紊亂、大部分不能連接成網狀、骨髓腔明顯擴大；戊酸雌二醇組：骨小梁排列緊密、連接成網狀、骨髓腔較小；九里香葉高劑量組：骨小梁明顯增粗、連接成網狀；九里香葉中劑量組：骨小梁較粗、骨髓腔較小；九里香葉低劑量組：骨小梁較粗、有斷裂、骨髓腔較小。見圖1至圖6。

2.3.2 與對照組比較，模型組骨小梁平均寬度及骨小梁面積百分率明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，九里香葉高劑量組骨小梁平均寬度及骨小梁面積百分率明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

3 討論

植物性雌激素可模擬雌激素作用，目前已成為國內外雌激素天然替代品研發的熱點。曾發揮[7]等學者證實九里香可能通過雌激素樣作用發揮保護軟骨作用。本研究切除大鼠雙側卵巢，使雌激素水平降低，誘發女性絕經后相似的骨量丟失和骨結構改變，建立骨質疏松癥的實驗模型[8-9]。探討九里香葉預防骨質疏松作用。

體積骨密度是由骨量和骨大小雙重因素決定的，骨體積對骨密度的高低起著重要的作用，體積骨密度更加符合骨力學強度變化的骨質疏松診斷指標[10]。實驗結果表明，大鼠去卵巢后，體積骨密度明顯降低，九里香葉高劑量組明顯提高大鼠體積骨密度，差異有統計學意義(P<0.05)，說明九里香葉高劑量給藥可改善骨力學指標變化，對骨質疏松有一定的防治作用。

圖1 模型組HE×100 圖2 對照組HE×100

圖3 戊酸雌二醇組HE×100 圖4 九里香葉高劑量組HE×100

圖5 九里香葉中劑量組HE×100 圖6 九里香葉低劑量組HE×100

組別骨小梁平均寬度/μm骨小梁面積百分率/%對照組44.75±1.9021.54±1.36模型組41.02±1.08▲19.16±1.61*戊酸雌二醇組42.68±1.09△20.86±1.02△九里香葉高劑量組42.39±1.16△20.90±1.01△九里香葉中劑量組41.02±1.4019.13±1.19九里香葉低劑量組40.66±1.0419.89±0.82

注：與對照組比較，*P<0.05，▲P<0.01，與模型組比較△P<0.05

骨無機質主要含有鈣(Ca)、磷(P)等礦鹽，是構成骨的硬度的主要成分，血清中Ca、P的檢測可間接反映骨礦物質變化情況。本研究中，九里香葉高劑量組血清Ca含量較模型組明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，鈣是維持骨量的基本物質[11]，提示九里香葉可影響骨礦代謝[12]。P含量各組之間比較差異均無統計學意義。血磷水平的穩定是骨生長和礦化的必要條件之一[13]。本實驗結果提示九里香葉對血磷水平無調節作用。堿性磷酸酶(ALP)主要存在于成骨細胞[14]，骨代謝速率增加的代謝性骨病血清ALP顯著升高[15]。本研究中，九里香葉中、低劑量組血清ALP含量較模型組顯著降低，其中九里香葉低劑量組差異有統計學意義(P<0.05)，提示九里香葉可影響骨代謝，沒有劑量依賴性。其機制可能與九里香葉具有雌激素樣活性，降低骨轉換率，間接減少骨吸收有關。ALP是反映成骨細胞的重要標志[16]，提示九里香葉可能也增加成骨細胞活性。

骨組織形態計量學可將二維圖像展示的骨組織和細胞結構進行定量分析，為骨結構、骨形成及骨吸收提供客觀數據[17]。可用以分辨骨質疏松的程度和性質[18]。本實驗結果顯示，去勢后小鼠骨小梁平均寬度、骨小梁面積百分率有明顯下降，九里香葉高劑量使去勢后小鼠骨小梁平均寬度、骨小梁面積百分率均明顯提高，說明骨的內部結構得到很好的恢復，對骨質疏松程度有明顯的改善作用。

綜上所述，九里香葉對去卵巢大鼠體積骨密度有改善作用、影響骨礦物質的代謝、對血液生化指標有一定的改善作用、可明顯影響骨組織形態學，但不呈劑量相關性。表明九里香葉具有預防骨質疏松作用，但具體作用機制還需進一步探討。

[1]郭培,柳航,朱懷軍,等.九里香化學成分和藥理作用的研究進展[J].現代藥物與臨床，2015,30(9):1172-1178.

[2]李林福,肖海,胡海波,等.九里香葉中的化學成分[J].中國實驗方劑學雜志,2016,22(7):50-53.

[3]單晶,王曉中,馬彥冬,等.九里香葉黃酮類成分的研究(Ⅰ)[J].中國藥學雜志，2010,45(24):1910-1912.

[4]黃鎖義,陽文輝,李衛彬,等.超聲波提取九里香總黃酮及其鑒別[J].時珍國醫國藥,2006,17(3)：395-396.

[5]劉冰語,章宸,呂海寧,等.HPLC方法同時測定九里香中的三個主要成分[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,2015,24(2):88-94.

[6]曹緯國,劉志勤,邵云,等.黃酮類化合物藥理作用的研究進展[J].西北植物學報,2003,23(12):2241-2247.

[7]曾發揮,劉海清,李林福,等.九里香雌激素樣作用及其對關節保護作用的初步研究[J].安徽農業科學，2013,52(24):9948-9950.

[8]陶若奇,張建東,顧九君,等.大豆異黃酮對去勢大鼠骨質疏松性骨折愈合的影響[J].臨床骨科雜志，2015，18(1):110-113.

[9]解秀蘭,孫曉麗,李麗娟,等.壯骨伸筋膠囊對去勢大鼠骨密度及骨代謝的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2016,22(14):121-124.

[10]劉文軍,廖進民,譚小云,等.椎體骨密度、體積骨密度與生物力學強度的比較[J].中國臨床康復，2004，8(5):880-881.

[11]李遠棟,王平,王為民,等.榮筋片治療腎虛血瘀型原發性骨質疏松癥的臨床療效觀察[J].世界中醫藥,2013,8(10):1162-1163.

[12]龍梓,劉丹霞,廖華衛,等.健骨片對去卵巢骨質疏松大鼠骨代謝骨微結構及骨強度的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2016，22(9):163-168.

[13]李燁,童杰,周衍晶,等.補腎壯骨中藥抗骨質疏松有效成分及其藥理作用研究進展[J].中國中藥雜志，2015，40(6):1038-1043.

[14]劉萬軍.注射用鼠神經生長因子治療骶骨骨折合并神經損傷的療效觀察[J].中國醫藥，2012,7(10)：1275-1276.

[15]張洋,楊少峰,卜淑敏.全身垂直振動對去卵巢骨質疏松大鼠血清和骨組織堿性磷酸酶水平的影響[J].中國運動醫學雜志，2013，32(1):41-44.

[16]劉慶利,權鐵剛,唐廣志,等.中藥治療對去卵巢大鼠骨質疏松動物模型血鈣、血磷、堿性磷酸酶與骨密度的影響[J].中國老年學雜志，2008，28(15):1527-1528.

[17]榮杰生,陶天遵,陶樹清.N-脫硫酸肝素對ICR雌性小鼠骨形態計量學的影響[J].中國骨質疏松雜志,2006,12(6):620-622.

[18]Jimi E，Nakamura I，Amano H，et al.Osteoclast function is activated by osteoblastic cells through a mechanism involving cell-to-cell contact[J].Endocrinology，1996，137(8):2187-2190.

EffectsofMurrayaPaniculatLeafonVolumetricBoneMineralDensity,Bloodcalcium,BloodPhosphorus,Alkalinephosphatase,boneHistomorphologyinOvari-ectomizedRats

Wen Yu1, LI Xiaohui2,You Wenzhi1, Zheng Qizhong3, Gao Hai4, Zhang Qiuping2, Peng Qinghua1

(1PharmacyDepartment,XiamenHospitalofTraditionalChineseMedicine,Xiamen361009,China; 2DrugClinacalTrialInstitution,XiamenHospitalofTraditionalChineseMedicine,Xiamen361009,China; 3DepartmentofPathology,XiamenHospitalofTraditionalChineseMedicine,Xiamen361009,China; 4DepartmentofScienceandEducation,XiamenHospitalofTraditionalChineseMedicine,Xiamen361009,China)

Objective:To observe the effect of Murraya Paniculat leaf on volumetric bone mineral density, blood calcium, blood phosphorus, Alkaline phosphatase, bone histomorphology in ovari-ectomized rats.MethodsA total of 60 SPF SD female rats were taken as models by removing bilateral ovaries. After 7 days of operation, all rats were divided into six groups：model group (normal saline, 0.4 mg/kg·d), control operation group (normal saline, 0.4 mg/kg·d), Estradiol Valerate group(0.4 mg/kg·d), Murraya Paniculat leaf high dose group (200 mg/kg·d), Murraya Paniculat leaf middle dose group (100 mg/kg·d) and Murraya Paniculat leaf low dose group (50 mg/kg·d). Drugs were given once a day for 90 days. Using electrode analysis to measure volumetric bone mineral density of rats and velocity method to measure blood calcium and blood phosphorus and alkaline phosphatase. Use HE staining on the right side of the femur of rats, then measured the average width and trabecular bone area percentage.ResultsCompared with the control group, volumetric bone mineral density of model group rats were reduced (P<0.05), blood phosphorus and Alkaline phosphatase of model group rats were lower, and the difference is significant (P<0.05), also, the average width and trabecular bone area percentage of model group rats were lower (P<0.05). No difference was found in blood phosphorus. Compared with model group, volumetric bone mineral density and blood calcium and the average width and trabecular bone area percentage were higher in Murraya Paniculat leaf high dose group (P<0.05). No difference was found in blood phosphorus. Also, alkaline phosphatase in Murraya Paniculat leaf low dose group was lower with significant difference (P<0.05).ConclusionMurraya Paniculat leaf could influence volumetric bone mineral density, blood calcium, blood phosphorus, alkaline phosphatase, the average width and trabecular bone area percentage in ovari-ectomized rats. It has anti-osteoporosis effect.

Murraya Paniculat; Bone mineral density; Blood calcium; Blood phosphorus; Alkaline phosphatase; Bone histomorphology

廈門市科技局計劃項目(3502Z50154056)

文娛(1977.06—)，女，碩士，主管藥師，臨床藥師，研究方向：中藥藥理，Tel:(0592)5574312，E-mail:xiaanwen@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.038

(2016-09-01收稿 責任編輯：徐穎)