作物保護研究中先導物的發現：農化產品發現的一種方法

侯文君 編譯

?

作物保護研究中先導物的發現：農化產品發現的一種方法

侯文君 編譯

(上海市農藥研究所，上海 200032)

全球人口持續增加，預期到2050年將達到90~100億。由于人口的增加和消費者對食物偏好的改變，明天全球的種植者將面臨前所未有的生產力需求壓力。與此同時，GDP持續升高，特別是亞洲和拉丁美洲，由此對更高品質的富含蛋白質食物的需求也增加了。面對此境況，卻有諸多的不利條件，如可耕地和淡水資源有限，當前種植者可用的農化產品也處于嚴峻的“生存環境”下。此生存環境主要是害物抗性的產生和害物的轉變；以及對作物保護產品的管理越來越嚴，一些產品的使用受到禁限用，或退出市場。總而言之，種植者利用有限生命期的農化產品在有限的土地上提高作物產量所面臨的壓力很大。因此，種植者渴望有新的技術和作物保護方案可用。

在對新作物保護解決方案非常需求的情況下，農化公司有必要開展先導物發現項目來開發新的、持續的解決方案。這些公司面臨的挑戰是如何及時、經濟有效地發現這些創新的方案。整個農化工業已采用許多先導物發現策略來增加成功發現先導物的可能性。道農科已建立一套促進先導物發現的方法。本文介紹了與先導物發現有關的概念，列舉了研究范例來更詳盡地展示了道農科應用的先導物發現的2個特別方法。

1 先導物發現方法

1.1 發現過程

農化公司長期可持續發展的關鍵是擁有開發高價值產品的強有力管道。在道農科發現工作就是確定新的、創新的化學和性狀解決方案，由此進入下一步的產品上市的前期開發階段。對于作物保護來說，這是指候選分子的發現過程。此過程由4個階段組成(圖1)：項目創建階段和隨后的類似物的選擇(1A階段)、類似物的表征(1B階段)和類似物的結構確認(1C階段)。

圖1 發現過程圖

在道農科，項目的創建主要被分為兩部分：先導物的發現和優化。先導物優化始于具有投資開發潛力的活性和新穎性的“先導”分子被確定后。在此階段開始對分子進行構-效關系研究。先導物的發現是發現過程的始端，在此階段，新的苗頭化合物或具有弱的所期望的生物活性的化合物被確定，并被改造為有效“活性物”。此后，進一步結構精修為先導分子，此先導物具有能滿足市場需求的重要生物特性。為此，本文中把苗頭化合物定義為在水平1篩選中達到一定活性的化合物。“活性物”是可合成的對靶標害物有活性的化合物，為進一步研究的起點。

如圖2所示，從苗頭化合物到開發前期的整個發現過程是不斷創新和假設驅動的研究過程。產品不是真正“發現”的，而是在反復的構-效關系探索和優化過程中“建起”的。此“建筑”過程包括對設計或改進活性、穩定性、植物吸收和運輸、溶解性和對哺乳動物和環境安全性等特性的假設驅動研究。這一般要求每一步都要對大量的類似物進行研究(圖2中以X代表)。當對SAR有較深的了解和選定候選分子后，要進行進一步的結構精修，增強受市場歡迎的特性。發現過程以及開發管道持續性的基礎就是先導物的發現，因為新穎先導化合物具有高價值，人們對其有很大的興趣。

1.2 先導物發現的方法

農化和醫藥公司已應用過多種方法來發現新先導化合物。圖3列出了其中一些重要的方法，圖中這些方法是以每種方法可知的生物數據或信息減少的順序排列。因此數據挖掘法包含較多的生物信息，而多樣性篩選或以結構多樣性為基礎的篩選一般缺少生物標準。另一方面，從列表的頂端到底部的方法，發現化學新穎性化合物的可能性逐漸增加。因此，列表下面的方法需要對大的化合物集進行生物篩選以增加發現活性物的幾率。列表頂端的方法要通過系統的、假設驅動的研究來了解化合物的活性特征，以及只有在反復的假設-試驗后才可能發現新穎的化學類別化合物。每種方法都存在利弊，因此在發現新先導物的過程中應用多種方法可能能夠有效平衡風險-收益關系。

圖2 從苗頭化合物到商業化產品前期開發前的發現過程

不同的方法間具有相似性和重疊性，可以不同的方式對各種方法進行分類。在道農科，主要通過3種方式發現先導物：競爭對手的啟發、天然產品和生物活性的假設(圖4)。最后一種方法包括圖3中所列的除競爭對手的啟發和天然產品研究以外的所有方法。

圖3 先導物發現方法

2 競爭對手啟發的先導物發現法

競爭對手啟發的先導物發現法建立在已發表文獻的知識上。這些信息來源包括同行評審的稿件、會議報告和已公布的專利申請。這些資料可以激發許多思路和方法的產生。而發現新穎先導物策略包括骨架遷越(scaffold hopping)、對主要活性元素進行生物電子等排體置換或對人們感興趣的結構基元和功能團進行精化。

圖4 在道農科先導物發現的方法

3 天然產物

3.1 機遇和篩選

天然產物篩選為充分利用天然存在的生物多樣性資源提供了機遇，增加了發現新穎活性分子的幾率。在過去，天然產物篩選為醫藥和農藥工業提供了很多開發思路和商業化產品。據估，約50%農化品銷售額與天然產品有關，故道農科以天然物為基礎的方法為先導物發現項目的主要部分。

道農科采用數種以天然產物為基礎的方法，其中包括篩選新天然產物。通過復雜的過程從各種資源得到了從分類、地理和環境學來說的生物多樣性天然物，繼而對這些天然物進行篩選，增加了發現新穎活性分子的機遇。一般每年測定上萬個天然產物提取物的農學活性，篩選到的分子具有可進一步研究的活性特性、新穎的結構基元。

3.2 天然產物先導物發現方法

從天然產物篩選項目得到的化合物主要被分為3種：不需要進一步優化就可商業化的新物質，需要進行一定的合成修飾(半合成)的活性分子和啟發進行全合成(合成模擬)開發的活性分子。在天然產物為基礎的發現項目中也可能發現新靶標作用位點，利用此靶標位點可進行篩選研究或確定能夠啟發開發新化學類型結構思路產生的新結構基元或新穎“骨架”。

直接從天然產物篩選得到具有所有需求特性且可作為有效的農化產品(如多殺菌素)分子的情況極罕見，所以這一般不被看作是天然產物篩選項目的主要結果。而天然產物篩選得到的活性分子可以作為進一步活性優化的起點。優化可能為對天然分子(半合成)進行1~2步的修飾，例如乙基多殺菌素和甲維鹽，或對天然產品的核心結構進行整體重構，如甲氧基丙烯酸酯和擬除蟲菊酯。

當天然物的物理特性(例如溶解性、光穩定性等)使其不適宜作為農化產品或從天然資源大量獲取不可行時，一般對天然產物進行全合成模擬。有的天然產物能夠被成功全合成模擬，且有高回報，但天然分子具有使其生物活性或對生物的特異性增加的獨特的、復雜的鍵鏈接和手性中心的情況少。

另一方面，半合成在2種條件下更成功，一為天然分子的活性具有或接近商業水平，需要修飾以增加田間活性。這可能涉及分子的穩定性或功能團的修飾來增加防效；另一條件為：能獲得充足的天然產物以進行修飾，或可通過發酵或如果分子不太復雜可合成獲得。

3.3 半合成研究——microcolin

William Gerwick等人篩選海產品提取物，結果發現具有廣譜殺蟲活性的數個類似物。這些物質被確定為天然產物microcolins。已有文獻報道了活性最高的acyltetrapeptide的結構，但沒有報道其殺蟲活性。化合物microcolin A對煙蚜夜蛾()和二斑葉螨()有活性(表1)，其LC50約為多殺菌素的10倍。其作用機制未知，初步的癥狀學、生化和電生理研究表明這是一種沒有商業開發的作用機制。

表1 Microcolins的殺蟲活性

MicrocolinTBW(LC50 mg/L)TSSM(LC50 mg/L) AR=AcR′=OH81 BR=AcR′=H304 CR=HR′=H-5 DR=H-R′=OH501 spinosad12

Microcolin A是一個可進一步修飾開發的物質，其活性需要被提高約10倍。因此集中對其SAR進行了研究，來確定主要的識別結構以及可被修飾提高活性的不穩定源。為此應用2個文獻報道的microcolin A合成路線：Decicco和Grover的總合成法和Andrus等人的中繼合成。這些合成路線為研究SAR奠定了基礎，希望有簡單的生物活性模板來迅速完成SAR的開發。因此靶標設計受到簡化結構工作的影響。

對分子的3部分進行了SAR研究，這3部分分別為脂肪酸酰胺、三肽和羥脯氨酸內酰胺(圖5)。對脂肪酸部分主要進行了不同非手性、親脂性基團取代研究。對三肽結構進行了不同氨基酸經組合化學方法合成以及選擇性取代酰胺氮研究。最后，研究了羥脯氨酸內酰胺來了解脯氨酸羥基的作用，以確定適宜的取代，能夠更易合成。

圖5 Microcolin的SAR研究

總之，發現分子的大部分結構不能被修飾。對于脂肪酸，一些修飾可降低對TSSM的活性，而所有修飾都使對TBW的活性消失。對三肽結構修飾一般會降低化合物的活性，氨基酸取代和-去甲基類似物使殺蟲活性喪失。發現只有亮氨酸的立構中心倒轉仍具有活性。脯氨酸的羥基只可酰化，而用氫或鹵素取代或立構中心倒轉后殺蟲活性大幅下降。最后，即使天然丁酰內酰胺發生微小的變化，如雙鍵的還原或甲基的修飾(例如去甲基或立體化學的轉化)都導致殺蟲活性的喪失。因此，雖然microcolin A具有不錯的殺蟲活性，可作為進一步修飾優化的起點，但其構-效關系譜非常窄，無法進一步的優化。

4 生物活性假設

4.1 定義和不同的方法

用生物活性假設法發現先導物需要不同水平的生物信息和假設的分子設計等廣泛知識(圖6)。化合物的設計來自于啟發新化學起點的多種思路、觀念、直覺和文獻。由此，又可被分為設計、化學或de novo的先導物發現法。然而，道農科把其定為“生物活性假設”先導物發現法，強調了在新化學設計和尋求中對一些具有生物活性影響元素的需求。

圖6 生物活性假設法

在研究中，為了得到希望的結果，會用一種方法或幾種方法。大多數情況下應用計算方法，包括數據驅動工作(數據探索和活性模型)、藥效團映射(基于片段、配體、藥效團、形狀的，骨架遷越)和配體-蛋白建模(基于靶標點)。在道農科，所有方法主要依賴于由多學科人員組成的團隊。總之，用于生物活性假設研究的所有方法的集合才是成功的先導物發現項目的完整要素。

生物活性假設的每一方法都有優點和缺陷。例如靶標位點方法很吸引人，因為具有未被商業開發的作用機制的新穎先導物的確定很受歡迎，然而確定的未開發仍然商業化的靶標位點很少。此外，當有趣的靶標位點已被確定和篩選大的化學庫的生測方法已被開發，而從這些篩選很少能確定具有適宜轉化特性的可行的或“ag-like”苗頭化合物。反之，常常能確定具有弱到無活體轉化性的離體苗頭化合物。把具有不利物理特性的離體苗頭化合物變構為具有有利物理特性的活體活性物質是項具有挑戰的任務，一般成功率有限。

為了抵消每種方法的不利影響，常采用一些策略。一種策略為可能應用2個或多個互補的方法以提高效用。例如，靶標點已知和有數個配體存在的新化學領域的研究可能應用基于混合配體/藥效團的方法和分子形狀篩選。在應用缺少生物信息的化學方法時，通過有效合成得到的大的“ag-like”庫可能增加發現可行的先導結構的幾率。

在圖6所列的方法中，從小的化學結構或有趣的骨架發展而來的優勢結構是一種有發展前途的發現新先導物的方法，因為此方法能夠把希望的物理特性并入到靶標分子的設計中。當骨架有一定獨特性或在開發中，新穎的骨架也是產生顯著不同于文獻中結構的一種方法。新穎骨架可被用作設計和合成含有載體基團或綁定元素等額外結構特征的期望目標化合物的基礎。期望的新穎骨架可能也具有一個重要的分子片段或識別元素，已發現或猜測其與生物活性有關。

在某些方面，新穎的骨架被認為與基于片段的方法相似，二者都是建立在一個或多個核心結構的活性或固有特性基礎上的模塊方法。在這2種情況下，片段或骨架被作為設計和合成復雜目標物的基礎，合成的物質含有載體基團或綁定元素等額外結構特征。然而與以片段為基礎的方法不同，新穎的骨架法不是根據已知靶標位點來發現先導物，得到的物質一般缺少生物活性，因此是一個更de novo法。基于片段的方法的另一不同處為，首先篩選片段，選擇，然后系統性地精化為先導結構。新穎的骨架法，憑借經驗來選擇片段或骨架，精化為靶標分子庫，然后篩選對整個植物或生物的活性。圖7為對這2種方法的比較。

4.2 新穎骨架研究案例——氟啶蟲胺腈

在基于骨架方法發現先導物前景的誘惑下，開始確定一組有發展前途的骨架進行進一步研究。候選的骨架分子量要相對小，具有氫鍵供體和/或受體，作為農化模板要新穎或在開發中，可被多點取代，具有合成多樣性而能被廣范取代。一個被選擇進行研究的骨架為亞砜酰亞胺基團(圖8)。雖然早在20世紀40年代就有亞砜酰亞胺的報道，但在農化產品的研究中其一直未被廣泛應用。此外，亞砜酰亞胺也是具有一個小的親水核、一個氫鍵受體和3個可被多樣取代的附著點的結構模板。

圖8 新穎骨架亞砜酰亞胺

對亞砜酰亞胺模板的R1、R2和R3取代得到數個不同的“探針”庫。取代基的選擇最初偏重于農化特征的輸入。起初著重制備多種多樣的化學庫，其化合物的R1、R2、R3有較多樣的取代。然而從這些化合物庫得到的重要苗頭化合物較少。所以，轉向重點開發被認為與殺菌活性有關的附加結構模板，包括芳氧基芐基基團(圖9，結構A)。隨后對此系列的R3基團進行取代開發得到了一個-硝基亞砜酰亞胺類似物，此物質的活性沒有引人注意的地方，只是對亞砜酰亞胺模板的骨架擴展以繼續研究。對與結構骨架(結構B)相關的靶標探尋最終發現了-硝基亞砜酰亞胺1，有較好殺蚜活性的一個類似物(桃蚜LC50=20 mg/L)。因此，亞砜酰亞胺1為新穎的先導物分子，用于進一步優化殺蚜活性。

對化合物1的系統性研究和優化最終發現了氟啶蟲胺腈2 (圖10)。氟啶蟲胺腈的活性(桃蚜LC50= 0.11 mg/L)比先導物的提高了約200倍。活性的提高是通過對亞胺取代(X)、不同鏈接系統(L)、尾部或封端基團(R)和取代的雜環系統(HET)進行了廣泛的研究所得到的結果。以前已報道了詳細的SAR研究。發現氰基取代亞胺氮、6-三氟甲基-3-吡啶和甲基，能提高化合物的殺蚜活性。對雜環和亞砜酰亞胺基團間連接鏈長度(圖11)與殺蚜活性間關系的分析表明一個碳亞甲基橋為最佳的鏈接。最后，亞甲基橋的甲基取代物具有最好的殺蟲活性。把以上所有優化組合在一起發現了氟啶蟲胺腈，此產品是對廣譜刺吸式害蟲，包括對現有許多殺蟲劑產生抗性的害蟲有高防效的商業化殺蟲劑。

圖9 殺蟲劑先導物的開發過程

圖10 導致氟啶蟲胺腈發現的SAR研究

雜環(HET)和亞砜酰亞胺基團間連接的碳原子數(L)

氟啶蟲胺腈是昆蟲煙堿乙酰膽堿受體的激動劑，與作用于相同受體的其他殺蟲劑的作用方式不同，如新煙堿類。特別是，氟啶蟲胺腈與靶標點的結合力相對弱，但產生非常強的nAChR電流，這是此殺蟲劑不同于其他作用于煙堿乙酰膽堿受體的殺蟲劑之處。氟啶蟲胺腈與涉入其他類型殺蟲劑抗性的代謝酶作用弱。其不易被與新煙堿殺蟲劑抗性有關的P450單氧化酶代謝。此獨特性是由于其化學和生化特性所致，故氟啶蟲胺腈被殺蟲劑抗性作用委員會分為4C類，而新煙堿為4A類。因此，氟啶蟲胺腈是作物生產中管理刺吸式口器害蟲的重要的新工具。

5 總 結

不斷增長的消費需求，害蟲抗性壓力和越來越嚴的管理環境，需要為現在和將來的種植者開發新的作物保護劑。先導物的發現是農化化學公司開發新的高價值產品的管道的重要“工程”。有多種方法可用于發現新的先導物，其中許多已被證明很成功。每一種方法都利弊共存，但可通過各種途徑來緩減彼此的風險，而在生物和化學方面有效銜接能提高先導物發現的成功率，這對假設驅動的研究很重要。在風險管理和先導物發現項目長期運行中應應用組合方法來發現新的先導物。

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2017.05.02

TQ450

A

1009-6485(2017)05-0004-05

侯文君，女，工程師，碩士。E-mail: sjnywp@163.com。

2017-10-09。