小反芻獸疫血清學檢測方法研究進展

劉丹丹 ， 杜方原 ， 馮春燕 ， 張永寧 ， 王彩霞 ， 仇松寅 ，劉曉飛 ， 王 勤 ， 吳紹強 ， 林祥梅

(中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所 ， 北京 大興 100176)

小反芻獸疫血清學檢測方法研究進展

劉丹丹 ， 杜方原 ， 馮春燕 ， 張永寧 ， 王彩霞 ， 仇松寅 ，劉曉飛 ， 王 勤 ， 吳紹強 ， 林祥梅

(中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所 ， 北京 大興 100176)

小反芻獸疫(Peste des petits ruminant,PPR)是由小反芻獸疫病毒(Pestedespetitsruminantvrius，PPRV)引起的一種能感染家畜和野生小反芻動物的高度接觸性傳染病，被世界衛生組織(OIE)列為A類疫病。PPRV是副黏病毒科麻疹病毒屬成員，僅存在一個血清型，主要感染山羊和綿羊。感染后康復及接種免疫后的動物可終身免疫。對急性、亞急性和癥狀不明顯的感染及免疫后的動物進行精準的PPRV特異性抗體檢測是目前血清學檢測的重要研究方向。

目前，PPR的檢測方法主要用來進行疫病診斷、疫病動態監測及其流行情況的調查，一些特殊檢測手段也用于PPR的地理分布和傳播特性的研究中。此外，為了實施精確有效的防控策略，有必要利用臨床和血清監測手段來定位疫病暴發的地點并監控疫病的傳播范圍。更快捷、更有效和更環保的同時能被大多數實驗室接受是目前PPR診斷試劑的研發方向。本文主要介紹現階段PPRV血清學檢測方法，以及相關抗原蛋白及抗原決定簇的研究進展。

1 PPRV不同病毒蛋白的免疫原性

抗原的免疫原性是通過體液免疫應答水平進行評估的。體液免疫能抑制病毒的復制，同時發生的細胞免疫反應也有助于殺死感染細胞。在野毒感染的急性期時表現出的過高熱反應標志著體液免疫應答的開始。產生免疫后，1周左右出現抗體，3～4周左右上升至平臺期。中和抗體是抵御病毒感染的第一道防線，對治療麻疹病毒屬病毒引起的疫病有重要的作用。PPRV能刺激機體產生IgM和IgG抗體，IgM很快消失，而IgG可穩定存在若干年，隨后水平降低但不會消失。疫苗產生的免疫保護力可持續1～3年[1]。

PPRV 蛋白的免疫學特性與血清學診斷息息相關。PPRV基因組為單股負鏈RNA，共編碼8種蛋白，其中6種是結構蛋白，包括核衣殼蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基質蛋白(M)、大蛋白(L)以及血凝素蛋白(H)和融合蛋白(F)[2]。6種結構蛋白中的3種病毒蛋白N、H和F可誘導產生免疫反應。蛋白N可誘導產生免疫反應，蛋白H和F誘導產生中和抗體。位于PPRV包膜內的F和H蛋白被制備成重組疫苗，用于免疫山羊。單獨或共同表達的重組蛋白都可誘導機體產生免疫力。接種重組羊痘病毒制備的疫苗，首次免疫后即可產生中和抗體。中和抗體滴度可在6個月內保持較高的滴度，且在再次感染后會迅速升高。羔羊獲得的母源抗體可抵御病毒侵害，說明PPRV抗體具有很強的保護效力[3]。

2 PPRV與同屬病毒的血清交叉反應性

由于麻疹病毒屬病毒的同源蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列相似，導致病毒之間具有交叉反應，是確診的難點之一。蛋白質序列分析表明，同源蛋白的同源區域可能代表病毒的結構相同或功能等效的區域[2,4]。用于疫病診斷的血清學試驗如免疫熒光法、補體結合試驗和瓊脂凝膠免疫擴散試驗等，都表明在麻疹病毒屬病毒的N、P、M、L和表面蛋白F中存在交叉反應。研究顯示，至少在反應初期，麻疹病毒(MV)/犬瘟熱病毒(CDV)、MV/牛瘟病毒(RPV)、RPV/PPRV以及CDV/海豚瘟熱病毒(PDV)表現出成對的交叉保護性。這些組合，除RPV/PPRV之外均被隨后的系統進化學研究所證實。研究表明，RPV/MV形成了系統進化的一個支系，而CDV/PDV 構成了另外一個支系。PPRV屬 RPV/MV支系的一個分支[5]。這些病毒中，RPV需要與PPRV 做鑒別診斷，因為這兩種病毒能在反芻動物中表現出相似的臨床癥狀。當兩種病毒的地理分布和宿主范圍一致時，做血清學監測尤為困難。雖然RPV已經被根除，但仍需進一步研發PPRV特異性血清學方法以減少PPRV同其他麻疹病毒之間的交叉反應。

3 PPRV血清學診斷的靶蛋白

研究顯示，在麻疹病毒屬病毒的表面蛋白中，只有H蛋白引起的病毒間的交叉反應較小。該蛋白主要影響細胞噬性，與宿主特異性信號淋巴細胞活化分子(SLAM)相結合誘發特異性的中和免疫反應[6]。PPRV的H蛋白具有血凝素活性[7]和神經氨酸酶活性[8]。通過構象序列結合，H蛋白的鼠單克隆抗體(mAbs)能識別并中和抗原表位來抑制神經氨酸酶的活性和血凝素的活性[9]?；贖蛋白的PPRV-mAb的檢測方法可用于血清學鑒別診斷。

相比較而言，F蛋白是病毒蛋白中最保守的蛋白。在PPRV中，F蛋白是主要的交叉保護性抗原，其C端和N端都具有保守性[4]。由于F基因的高度同源性，它主要用于PPRV的分子流行病學研究[10-11]。

麻疹病毒屬病毒的N蛋白具有較高的抗原保守性。N蛋白位于病毒的核心部位，含量高，具有高度免疫原性。PPRV N蛋白的氨基酸序列分為中度保守的氨基端，高度保守的中心區以及覆蓋105個aa的極不保守的羧基端3個區域。PPRV N蛋白抗原表位可以通過mAbs檢測，還可通過免疫或感染牛羊的陽性血清加以確認[12]。研究發現，N蛋白的單克隆抗體可以區分PPRV和RPV，可用于PPRV ELISA檢測試劑盒的研發。

4 血清學檢測方法

目前主要用血清學檢測結合臨床癥狀及流行病學來確診PPR。臨床上PPR易同出血性敗血癥(Hemorrhagic septicemia)、山羊傳染性胸膜肺炎(Goat contagious pleural pneumonia,CCPP)及RP混淆。PPRV血清學檢測方法最常用的是病毒中和試驗(VNT)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，較少應用的是血凝抑制試驗(HI)和間接免疫熒光試驗(IFA)方法。

4.1 血凝抑制試驗(HI)和間接免疫熒光試驗(IFA) HI是一種便捷廉價的血清學檢測手段，但由于其易與麻疹病毒屬的其他病毒產生交叉反應而少有應用。IFA是一種將抗原抗體反應與顯微示蹤相結合的技術，利用血清和相應的熒光標記物孵育，在熒光顯微鏡下，可以直接觀察特異性熒光及其存在的位置。由于該方法需要特殊的儀器設備，僅限于實驗室檢驗。

4.2 病毒中和試驗(VNT) VNT是最早用的檢測PPRV抗體的血清學方法，也是OIE陸生動物手冊中推薦的國際貿易檢測方法[13]。VNT是利用抗體對病毒的中和作用，通過觀察中和反應后血清與病毒混合液引起的細胞病變來測定血清中的抗體及其效價。該方法最早應用于牛瘟，在牛瘟根除計劃[14]中發揮了重要作用。但該方法過于繁瑣且需要培養病毒和細胞，不適用于大規模監測。目前該方法作為鑒別手段僅用于實驗室的研究，也用于評估新的檢測方法及對未知種群、駱駝、易感PPRV野生物種的靈敏度和特異性。

4.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 目前建立的PPRV的ELISA檢測方法主要分為間接ELISA法、阻斷ELISA法及競爭ELISA法。隨著桿狀病毒表達系統和原核表達系統的發展，ELISA包被的抗原由原來的全病毒發展為重組蛋白、合成肽等。

4.3.1 間接ELISA法 間接ELISA法是先包被抗原，加入待檢血清，利用酶標記的抗抗體檢測與固相抗原結合的待檢血清。2007年Balamurugan[3]等建立了PPRV的間接ELISA法，包被抗原為PPRV全病毒?，F在間接ELISA法使用的抗原多為由桿狀病毒表達或原核表達的重組PPRV N蛋白，相較于病毒而言，重組蛋白更易制備、更特異、更安全，無PPRV感染的國家也可以應用[15]。間接ELISA法操作簡便，但該檢測方法難以區分麻疹病毒屬病毒交叉反應，因此常用于初步篩查試驗。

4.3.2 阻斷ELISA法與競爭ELISA法 阻斷ELISA法和競爭ELISA法都是先包被抗原，檢測待檢血清中的抗體。阻斷ELISA法原理是先將待檢血清同包被的抗原進行孵育，然后加入H蛋白特異性單克隆抗體，待檢血清阻斷H蛋白與H蛋白的單克隆抗體結合，導致加入酶標抗二抗的抗體和顯色液后陽性血清顏色減退。競爭ELISA法是將待檢血清和特異性單克隆抗體同時加入反應板，待檢血清與H蛋白特異性單克隆抗體競相結合包被的抗原，導致加入的酶標抗二抗的抗體和顯色液后陽性血清顏色較淺。和競爭ELISA法相比，阻斷ELISA法敏感性和特異性更好。競爭ELISA法應用廣泛在非洲、中東和亞洲的PPR診斷中，準確性非常高，目前被英國BDSL公司商品化。有研究顯示，相對于高度特異的牛瘟競爭ELISA，PPR競爭ELISA法有時會檢出牛瘟抗體，尤其是檢測牛瘟免疫后的動物時，PPR競爭ELISA法的特異性會明顯下降[16]。

4.3.3 基于多肽或抗原表位的ELISA法 雖然競爭ELISA法應用廣泛，但由于位阻現象，與牛瘟有一定的交叉反應[16]。為了研發更特異的血清學檢測方法，首先要識別具有免疫顯性且針對PPRV的抗原表位和結構域，合成單一的抗原表位。短合成肽的優勢是它能消除非特異性反應或位阻現象更特異。此外，這種方法還無需培養病毒或制備單克隆抗體。由于在所有結構蛋白中，N蛋白是病毒豐度最高的蛋白，可迅速引起機體產生抗N的免疫應答，因此N蛋白的氨基酸序列被選為PPRV的特異抗原表位的代表。對N蛋白的晶體結構進行分析，顯示PPRV N蛋白的多變區具有高免疫原性。比較N蛋白多變區肽段和山羊抗PPR血清以及兔抗牛瘟血清這兩者的反應，能快速精準地辨識出針對PPR的抗原表位。Dechamma[17]等的研究顯示，N末端區域的肽132STEGPSSGSKKRIN144、C末端區域的肽433ATREEVKAAIP443和454RSGKPRGETPGQLLPEIMQ472與PPRV 抗體的高度特異反應，且與牛瘟血清的反應較少。為進一步提高PPRV競爭ELISA反應的特異性，研究者們致力于通過PPRV N蛋白抗原表位的免疫原性和特異性來制造多克隆抗血清以取代肽基ELISA的單克隆抗體。改進后的基于抗原表位的競爭ELISA(peptide-based ELISA)更加敏感和特異[18]。

4.4 PPRV標記疫苗配和血清學檢測的方法 目前現有的檢測方法并不能區分免疫動物和感染動物。因此，建立PPRV標記疫苗和配套檢測方法將有助于制定免疫策略，控制疫病的流行。最理想的情況是，血清學監測可以鑒別和區分野毒感染的動物、免疫動物以及野毒和免疫共同感染的動物。Buczkowski[19]利用反向遺傳技術構建了第一個RPV H蛋白單表位缺失的負標記疫苗，能有效區分接種動物與感染動物，為研發PPRV標記疫苗奠定了良好的基礎。PPRV標記疫苗和配套檢測方法將成為無疫國家或地區防控突發PPR的理想工具，并且將成為比撲殺政策更經濟適用的方法。此外，標記疫苗將降低監測成本并加快疫病控制和根除。

5 小結

競爭ELISA法是準確、標準和高效的檢測方法，可評估因感染或注射疫苗引起的免疫反應。因傳統的VNT受試驗條件所限，競爭ELISA檢測方法有望成為VNT的替代檢測方法。針對單一表位的單克隆抗體技術的應用顯著提高了競爭ELISA法診斷的特異性。該方法可用于檢測所有流行國家和無疫國家的小反芻獸樣本。雖然還未證實野生動物是PPRV的儲存宿主，但已證實它們可以通過家養動物受到感染[20]，利用準確的血清學檢測方法對野生動物的PPR進行監測，掌握其流行狀態與該疫病的防控息息相關。

近年來，人們逐漸認識了PPR的破壞性及其對國家經濟、食品安全帶來的巨大影響，國際組織開始重視該病。PPR的危害性迫使我們必須盡快開展全球范圍的防控和根除計劃?？焖贉蚀_的血清學診斷是疫情暴發時的首要舉措，也是防止疫病進入國門的必要手段。

表1 ELISA方法

[1] Diallo A, Minet C, Le G C,etal. The threat of peste des petits ruminants: progress in vaccine development for disease control[J]. Vaccine, 2007, 25(30):5 591-5 597.

[2] Bailey D, Banyard A P, Ozkul A,etal. Full genome sequence of peste des petits ruminants virus, a member of the Morbillivirus genus[J]. Virus Research, 2005, 110(1-2):119-124.

[3] Balamurugan V, Sen A, Venkatesan G,etal. Study on Passive Immunity:time of Vaccination in Kids Born to Goats Vaccinated Against Peste des petits ruminants[J]. Virologica Sinica, 2012, 27(4):228.

[4] Chard L S, Bailey D S, Dash P,etal. Full genome sequences of two virulent strains of peste-des-petits ruminants virus, the Cte d’Ivoire 1989 and Nigeria 1976 strains[J]. Virus Research, 2008, 136(1-2):192-197.

[5] Minet C, Yami M, Egzabhier B,etal. Sequence analysis of the large (L) polymerase gene and trailer of the peste des petits ruminants virus vaccine strain Nigeria 75/1: expression and use of the L protein in reverse genetics[J]. Virus Research, 2009, 145(1):9-17.

[6] Vongpunsawad S, Oezgun N, Braun W,etal. Selectively receptor-blind measles viruses: Identification of residues necessary for SLAM-or CD46-induced fusion and their localization on a new hemagglutinin structural model[J]. Journal of Virology, 2004, 78(1):302-313.

[7] Osman N A, A/Rahman M E, Ali A S,etal. Rapid detection of Peste des Petits Ruminants (PPR) virus antigen in Sudan by agar gel precipitation (AGPT) and haemagglutination (HA) tests[J]. Trop Anim Health Prod, 2008, 40(5):363-368.

[8] Seth S, Shaila M S. The hemagglutinin-neuraminidase protein of peste des petits ruminants virus is biologically active when transiently expressed in mammalian cells[J]. Virus Research, 2001, 75(2):169-177.

[9] Renukaradhya GJ, Sinnathamby G, Seth S,etal. Mapping of B-cell epitopic sites and delineation of functional domains on the hemagglutinin-neuraminidase protein of peste des petits ruminants virus[J]. Virus Res,2002,90:171-185

[10] Banyard A C, Parida S, Batten C,etal. Global distribution of peste des petits ruminants virus and prospects for improved diagnosis and control[J]. Journal of General Virology, 2010, 91(Pt 12):2 885-2 897.

[11] Munir M, Zohari S, Berg M. Molecular Biology and Pathogenesis of Peste des Petits Ruminants Virus[J]. Springerbriefs in Animal Sciences, 2013.

[12] Bodjo S, Kwiatek O, Diallo A,etal. Mapping and structural analysis of B-cell epitopes on the morbillivirus nucleoprotein amino terminus[J]. Journal of General Virology, 2007, 88(4):1 231-1 242.

[13] OIE manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals[S]. Version adopted in May 2013.Chapter 2.7.11. Accessed 10 July 2013.

[14] Kock R A, Wamwayi H M, Rossiter P B,etal. Re-infection of wildlife populations with rinderpest virus on the periphery of the Somali ecosystem in East Africa[J]. Preventive Veterinary Medicine, 2006, 75(1-2):63-80.

[15] Zhang G, Zeng J, Zhu Y,etal. Development of an Indirect ELISA with Artificially Synthesized N Protein of PPR Virus[C]// 上海市畜牧獸醫學會2011年學術年會. 2011:12-20.

[16] Couacyhymann E, Bodjo S C, Tounkara K,etal. Comparison of two competitive ELISAs for the detection of specific peste-des-petits-ruminant antibodies in sheep and cattle populations[J]. African Journal of Biotechnology, 2007, 6(6):732-736.

[17] Dechamma H J, Dighe V, Kumar C A,etal. Identification of T-helper and linear B epitope in the hypervariable region of nucleocapsid protein of PPRV and its use in the development of specific antibodies to detect viral antigen[J]. Veterinary Microbiology, 2006, 118(4):201-211.

[18] Zhang G R, Yu R S, Zeng J Y,etal. Development of an epitope-based competitive ELISA for the detection of antibodies against Tibetan peste des petits ruminants virus[J]. Intervirology, 2013, 56(1):55-59.

[19] Buczkowski H, Parida S, Bailey D,etal. A novel approach to generating morbillivirus vaccines: Negatively marking the rinderpest vaccine[J]. Vaccine, 2012, 30(11):1 927-1 935.

[20] Abubakar M，Mahapatra M, Muniraju M,etal. Serological Detection of Antibodies to Peste des Petits Ruminants Virus in Large Ruminants[J]. Transboundary & Emerging Diseases, 2015, 64(2):513-519.

S816

A

0529-6005(2017)09-0065-04

2017-06-07

國家重點研發計劃(2016YFC1201603)；十二五國家科技支撐計劃(2013BAD12B01)；國家自然科學基金青年科學基金項目(31402171)

劉丹丹(1982-)，女，碩士，從事動物檢疫工作，E-mail: ken0439@163.com

杜方原(1990-)，女，碩士，從事動物檢疫工作，E-mail:dufy@caiq.gov.cn

注：杜方原與劉丹丹對本文具有同等貢獻

吳紹強，E-mail:wusq@caiq.gov.cn;林祥梅，E-mail:linxm@caiq.gov.cn