鳳尾草乙醇提取物體外抑菌試驗方法的篩選

南蘋瑤 ， 王小鶯 ， 黃欣彥

(1江西農業大學動物科技學院 ， 江西 南昌 330045 ； 2江西省寧都縣畜牧獸醫局 ， 江西 寧都 342800)

鳳尾草乙醇提取物體外抑菌試驗方法的篩選

南蘋瑤1， 王小鶯1， 黃欣彥2

(1江西農業大學動物科技學院 ， 江西 南昌 330045 ； 2江西省寧都縣畜牧獸醫局 ， 江西 寧都 342800)

為了篩選鳳尾草乙醇提取物體外抑菌試驗最佳方法，通過打洞法、牛津杯法、干、濕紙片法、二倍稀釋法測定乙醇以及中藥鳳尾草乙醇提取物對大腸桿菌的體外抗菌效果。結果二倍稀釋法中乙醇的最低抑菌濃度為6.25%；無水乙醇在打洞法、牛津杯法、紙片法、二倍稀釋法中均無抑菌圈；鳳尾草乙醇提取物在打洞法、牛津杯法、濕紙片法中抑菌圈直徑分別為20±1 mm、14±1 mm、13±2 mm；鳳尾草乙醇提取物在干紙片法中無抑菌圈。 表明無水乙醇可作中藥提取物的溶劑用于打洞法、牛津杯法、濕紙片法；打洞法用于鳳尾草乙醇提取物的體外抑菌試驗重復性好，抑菌圈質量高。

鳳尾草 ； 乙醇 ； 瓊脂打洞法 ； 紙片法 ； 牛津杯法

體外抑菌研究方法廣泛應用于藥物篩選、活性物質追蹤、抗菌譜效價測定及臨床上藥敏試驗等工作中，是直接評價藥物抗菌效能的經典試驗方法[1]。大量試驗表明，許多的中藥都會使用有機溶劑提取其活性成分，且以水為溶劑的提取物劣于有機溶劑提取物的效果。鳳尾草乙醇提取物在水中溶解度低[2]，選擇乙醇作為溶劑進行體外抑菌試驗，需考察溶劑乙醇是否對體外抑菌試驗產生影響。本文通過比較試管二倍稀釋法、紙片法、打洞法、牛津杯法幾種常用方法，探討鳳尾草乙醇提取物體外抑菌試驗的最佳方法，為鳳尾草有效成分的后續研究提供方法，也為中藥的體外抑菌試驗提供參考。

鳳尾草是鳳尾蕨科鳳尾蕨屬中的一種，又稱雞尾草，鐵腳雞，井欄邊草等。一般在四月采挖帶根全草，洗凈曬干。具有涼血止血，清腫解毒，清熱利濕，抗菌消炎等功效。可以治療痢疾，腸炎，黃疸型肝炎，胃腸炎，乳腺炎，扁桃體炎，便血，吐血，白帶，濕疹等疾病，外治出血，燒、燙傷等。具有廣譜抗菌，抗腫瘤，抗病毒的作用[3]。

1 試驗材料

1.1 材料與方法 藥材： 鳳尾草全草采于江西農業大學校園內(經江西農業大學林學院教授鑒定)，清洗干凈，置于電熱恒溫鼓風干燥箱60 ℃干燥備用。

菌種： 大腸埃希菌ATCC25922，購自廣東省微生物菌種保藏中心。

儀器與設備： 旋轉蒸發器(RE5298A,上海亞榮生化儀器廠)；循環水式真空泵(SHZ-DⅢ鞏義市予華儀器有限責任公司);粉碎機(DFT-100，溫嶺市林大機械有限公司)；雙人單面凈化工作臺(SW-CJ-2D,蘇州凈化設備有限公司)；生化培養箱(韶關市泰宏醫療器械有限公司)；電子天平(ESJ220-4G,沈陽龍騰電子有限公司)；恒溫培養搖床(SKY-1102C,上海蘇坤實業有限公司)；超聲波清洗機(SB-5200DTDN,寧波新芝生物科技股份有限公司)；自動雙重純水蒸餾器(SZ-93，上海亞榮生化儀器廠)；立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KBS,上海申安醫療器械廠)；數顯恒溫水浴鍋(HH-4，國華電器有限公司)；移液槍。

1.2 方法

1.2.1 鳳尾草乙醇提取物的制備 采集于江西農業大學校園內的鳳尾草全草，去雜清洗干凈，放置于電熱恒溫鼓風干燥箱60 ℃干燥備用。用刀或剪刀將鳳尾草破碎成1～4 cm的碎片，粉碎成粉末。稱取鳳尾草粉末10 g，70%乙醇溶液，1∶30的料液比下，浸泡30 min后，在50 ℃溫度加熱回流提取3次，每次30 min，合并3次提取液。去濾渣后，50 ℃～60 ℃ 下旋轉蒸發至膏狀物，得到的膏狀物為0.36 g。用7 mL無水乙醇在超聲波下溶解，配成生藥質量濃度為1 429 mg/L，過濾除菌，置冰箱4 ℃冷藏保存。

1.2.2 培養基的制備 麥康凱瓊脂培養基：取麥康凱瓊脂粉末12.5 g，加入裝有250 mL蒸餾水的錐形瓶中，加熱煮沸溶解并攪拌，121 ℃高溫滅菌20 min后備用。未冷卻凝固時分別倒入12個滅菌干燥的培養皿中，等待瓊脂冷卻凝固。冷卻后4 ℃冷藏備用。

普通營養瓊脂：取營養瓊脂粉8 g，加入裝有250 mL蒸餾水的錐形瓶中加熱煮沸溶解并攪拌，121 ℃高溫滅菌20 min后備用。未冷卻凝固時分別倒入12個滅菌干燥的培養皿中，等待瓊脂冷卻凝固。冷卻后4 ℃冷藏備用。

MH肉湯培養液：MH肉湯粉末7.5 g，加入裝有250 mL蒸餾水的錐形瓶中加熱煮沸溶解并攪拌，121 ℃高溫滅菌20 min后備用。冷卻后4 ℃冷藏備用。

1.2.3 菌液的制備 取冷凍保存的塑料凍存管，立即放置在38 ℃～40 ℃水浴中快速復蘇并適當搖動。直到內部結冰完全溶解為止，一般約50 s～100 s，開啟塑料凍存管，吸取菌液移植于麥康凱瓊脂培養基上，37 ℃恒溫培養18～24 h。挑取該麥康凱瓊脂培養基上的單個菌落接種至另一麥康凱瓊脂培養基上進行菌種復蘇。采用平板計數法進行細菌計數，勾取平板上菌落1～2個，置于MH肉湯中，37 ℃ 恒溫振蕩培養至對數生長期后進行細菌計數。菌液4 ℃冰箱保存備用，臨用前稀釋為106CFU/mL。

1.2.4 濾紙片的制備 將定性濾紙用打孔器制成6 mm直徑的圓片，放入干燥的培養皿內，經121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后，干燥保存備用[4]。

1.2.5 體外抑菌試驗

1.2.5.1 溶劑乙醇對大腸桿菌的抑制作用 試管二倍稀釋法：按劉佩沂等的試管稀釋法，取7支滅菌試管，每1管中均加入1 mL稀釋好的菌液，第1管中加入1 mL無水乙醇溶液，混合均勻后，從第1管移1 mL至第2管，做二倍稀釋后面依次重復稀釋直到第7管，第7管多余的1 mL棄去，再取1支試管加入1 mL稀釋好的菌液作為空白對照，做3組重復后，37 ℃恒溫條件下培養18～24 h后，無細菌生長的最小藥物濃度即為乙醇的 MIC值[5]。

瓊脂打洞法：拿滅菌棉簽將稀釋好的菌液均勻地涂抹在麥康凱瓊脂上，室溫干燥5 min后，用無菌打孔器(直徑6 mm)在麥康凱瓊脂平板上打孔，以無菌針頭挑出孔內瓊脂。滴少量的未凝固的瓊脂于孔內封底，防止藥液從孔底流走。按梯度100%、90%、80%、70%、60%、50%乙醇溶液依次滴入孔內，每個孔50 μL，每個梯度重復3次，放置 30 min 后，37 ℃培養箱中培養18～24 h后觀察抑菌圈大小，求平均值。

牛津杯法：用滅菌棉簽將稀釋好的菌液均勻地涂抹在麥康凱瓊脂上，室溫干燥5 min后，在標記的位置上分別放牛津杯6個，按梯度100%、90%、80%、70%、60%、50%乙醇溶液依次滴入牛津杯內，每個 50 μL，每個梯度重復3次，放置30 min后，37 ℃培養箱中培養18～24 h后觀察抑菌圈大小，求平均值。

紙片法：用滅菌棉簽將稀釋好的菌液均勻地涂抹在麥康凱瓊脂上，室溫干燥5 min后，按梯度100%、90%、80%、70%、60%、50%取滅菌的紙片依次用滅菌鑷子夾起，并分別滴5 μL乙醇溶液后依次沾到瓊脂上，放置30 min后，37 ℃培養箱中培養 18～24 h后觀察抑菌圈大小，求平均值。

1.2.5.2 鳳尾草乙醇提取物的體外抑菌效果 (1)瓊脂打洞法：瓊脂平板涂菌、打洞、封底后，其中3個孔每個孔滴加50 μL藥液，無水乙醇作溶劑對照， 靜置40 min后，置37 ℃培養箱內培養18～24 h后觀察抑菌圈大小，計算平均值;(2)牛津杯法：瓊脂平板涂菌、放置牛津杯后，選3個杯每個滴50 μL藥液，其余3個杯每個滴50 μL無水乙醇作溶劑對照，靜置45 min后，置37 ℃培養箱內培養18～24 h后觀察抑菌圈大小，計算平均值;(3)干紙片法：取滅菌的濾紙片放入滅菌離心管中，每片紙片滴5 μL藥液，置干燥箱干燥備用。用滅菌棉簽均勻的涂抹稀釋好的菌液于麥康凱瓊脂平板上，室溫干燥5 min后，將干燥好的藥物紙片依次放到瓊脂上，37 ℃培養箱中培養18～24 h后觀察抑菌圈大小，求平均值;(4)濕紙片法：瓊脂平板涂菌，取3片滅菌的紙片依次用滅菌鑷子夾起，分別滴5 μL藥液滲透紙片，依次放在標記的位置，另取無菌干燥的空白濾紙片滴5 μL無水乙醇作溶劑對照放置于瓊脂上，靜置40 min后，37 ℃培養箱中培養18～24 h后觀察抑菌圈大小，求平均值。

2 結果

2.1 溶劑乙醇對大腸桿菌的體外抑菌試驗 試管二倍稀釋法中溶劑乙醇對大腸桿菌的MIC值為6.25%。瓊脂打洞法、牛津杯法、紙片法測定100%、90%、80%、70%、60%、50% 6個梯度的乙醇溶液對大腸桿菌抑菌試驗結果均無抑菌圈。因此在研究中藥提取物的體外抑菌試驗時，用無水乙醇溶解提取物在瓊脂打洞法、牛津杯法、紙片法試驗中不會對試驗結果產生影響。

由于在試管法中乙醇對大腸桿菌的抑菌濃度較低，如果用無水乙醇溶解鳳尾草提取物，則使用試管二倍稀釋法測定鳳尾草體外抑菌活性時，乙醇的濃度會對大腸桿菌產生抑菌作用，必須注意乙醇的濃度。

2.2 鳳尾草乙醇提取物對大腸桿菌的體外抑菌效果 干紙片法中鳳尾草提取物對大腸桿菌幾乎無抑菌圈，表明鳳尾草乙醇提取物水溶性差，很難在瓊脂中擴散；濕紙片法、牛津杯法所得平均抑菌圈直徑分別為13 mm、14 mm；濕紙片法所用藥液量為牛津杯法的十分之一，但濕紙片法重復性不好。瓊脂打洞法平均抑菌圈直徑達到20 mm，抑菌圈質量高、重復性好，操作簡單、方便快捷, 可優先選用為鳳尾草乙醇提取物的體外抑菌試驗方法。結果見表1。

表1 鳳尾草無水乙醇提取物體外抑菌試驗結果

注：抑菌圈直徑包括孔徑、牛津杯直徑和濾紙片直徑

圖1 擴散法體外抑菌試驗結果

注：A:瓊脂打洞法; B:牛津杯法; C:濕紙片法； ①、②、③均為鳳尾草提取物，④、⑤、⑥均為無水乙醇

3 討論

3.1 各種體外抑菌試驗方法具有一定的適應性 試管二倍稀釋法作為定量測定法，結果較為準確、但操作繁瑣，具有局限性。對于用乙醇、二甲基亞砜等有機溶劑溶解中藥提取物用于試管二倍稀釋法測定MIC時，應考慮溶劑對細菌的作用；本次試驗中乙醇對大腸桿菌的MIC值為6.25%。如用乙醇溶解鳳尾草提取物，則在試管二倍稀釋法中第一支試管的乙醇濃度高達50%，建議試管二倍稀釋法測定MIC時，一定要考慮溶劑對細菌的抗菌活性。

牛津杯法測定鳳尾草抑菌作用，具有直觀、重復性好、載藥量多等優點，但結果擴散效果一般，且操作需要非常小心，否則容易致牛津杯法在瓊脂表面滑落，藥物在菌群中滲透不均勻，所得抑菌圈不規則；瓊脂打洞法要求熟練掌握打洞技術，封底用的瓊脂要趁熱防止凝固，藥液需加夠量防止抑菌圈不明顯。在本試驗中瓊脂打洞法與牛津杯法中所用等量的鳳尾草乙醇提取物50 μL，打洞法的抑菌圈大于牛津杯法；濕紙片法載藥量較少、精確度不高。因此，瓊脂打洞法可用于鳳尾草體外抑菌試驗的研究。

3.2 影響各種體外抑菌試驗結果判定的因素多 影響結果判定的因素有很多，如藥物的濃度、用量、藥物對細菌的培養時間、敏感程度、培養溫度、菌液濃度，或瓊脂上水分多少；紙片法中紙片的大小、保存時間、干燥程度、紙片質量、載藥量都會影響結果；打洞法時瓊脂的厚薄均勻程度、封底是否做好；稀釋法是否混合均勻程度，牛津杯的選擇等[6]。

3.3 現用中藥體外抑菌試驗方法存在不足 中藥鳳尾草純天然、毒副作用小、功能諸多、療效好、不容易產生抗藥性等優點，但鳳尾草成分復雜，使用歷史悠久，提取條件、助溶劑的選擇、分離方法的選擇都會影響結果。對于有些中藥，其煎液在高壓121 ℃蒸汽滅菌時，會導致中藥某些藥理活性降低，中藥的部分有效成分被破壞[7]，有效成分被破壞使體內外抑菌試驗結果有大不同。因此，開始中藥的抑菌研究時，應對中藥的劑型、提取條件、方法、有效組分分離等作充分考慮，且提高操作水平，設置對照組和重復組，以保證試驗結果的準確性和真實性。

[1] 張邑帆, 朱買勛, 鄭華, 等. 不同復方中藥提取液止瀉效果的研究[J]. 中國獸醫雜志, 2015,51 (12): 62-64.

[2] 錢晶晶. 鳳尾草抑菌活性成分提取及其抑菌作用的初步研究[D].南昌：江西農業大學, 2015.

[3] 劉建群, 劉健, 蔣偉, 等. 鳳尾草藥材質量標準研究[J]. 中國中藥雜志, 2015 (10): 1 855-1 859.

[4] 周喜翠. 簡易藥敏紙片的制作和應用[J]. 北方牧業, 2005, (23): 27.

[5] 劉佩沂, 鄧秋狄, 田素英. 肺熱清解口服液及其總黃酮的抗菌、解熱作用對比研究[J]. 今日藥學, 2012(10): 588-591.

[6] 榮先娣, 游佩琇. 篩選抗綠膿桿菌中藥的實驗研究[J]. 河南中醫, 1988(05): 44-45

[7] 李國旺, 苗志國, 趙恒章. 板藍根等10種中草藥對沙門氏菌的體外抑菌試驗[J]. 貴州農業科學, 2010,38 (2): 142-144.

S853.74

B

0529-6005(2017)09-0062-03

2017-04-01

江西省科技廳重點研發計劃項目(20161BBF60088)

南蘋瑤(1995-)，女，碩士生，研究方向為獸醫藥理學及毒理學，E-mail:2280425155@qq.com

王小鶯，E-mail:wangxiaoying6969@126.com