山東省雞致病性大腸桿菌的分離鑒定

李偉躍 ， 張蘭鳳 ， 李勝美 ， 石 英

(1.山東畜牧獸醫職業學院 ， 山東 濰坊 261061 ； 2.山東省濰坊新華中學 ， 山東 濰坊 261061)

山東省雞致病性大腸桿菌的分離鑒定

李偉躍1， 張蘭鳳2， 李勝美2， 石 英1

(1.山東畜牧獸醫職業學院 ， 山東 濰坊 261061 ； 2.山東省濰坊新華中學 ， 山東 濰坊 261061)

雞的大腸桿菌病是由某些血清型的大腸桿菌引起的一類疾病，隨著養雞業的集約化發展，該病的傳播越來越嚴重，對養雞業造成的經濟損失巨大。為明確本省致病性大腸桿菌的血清型、有針對性地研究預防和治療雞大腸桿菌病的藥物和方法，對山東省雞致病性大腸桿菌進行了分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 病料及分型血清 病料采自山東省德州市獸醫站禽病門診、淄博市獸醫站禽病門診、沂水縣獸醫站禽病門診，膠州市、萊州市、臨朐縣等多個肉雞養殖場和禽病門診的疑似大腸桿菌病的病、死雞，具有典型肝周炎、心包炎解剖病變的病死雞的脾臟、肝臟、心血等病料。大腸桿菌標準菌株ATCC25922和大腸桿菌標準抗“O”血清，均購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 試劑和培養基 三糖鐵瓊脂、營養肉湯、普通營養瓊脂培養基，購自北京奧博星生物技術有限責任公司；麥康凱、伊紅美蘭瓊脂，購自北京陸橋技術有限責任公司；葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇微量發酵管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽瓊脂、革蘭染色液、0.5%石炭酸生理鹽水、吲哚試劑、V-P試劑、M-R試劑等由實驗室自行配制。

1.3 試劑配制方法 以下試劑按照參照參考文獻[1]進行配制。蛋白胨水：蛋白胨 1 g，氯化鈉 0.5 g，蒸餾水100 mL。將蛋白胨、氯化鈉加入蒸餾水中，加熱溶解后調pH值為7.6，再煮沸加熱30 min。待冷后用濾紙過濾，分裝，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。葡萄糖蛋白胨水： 蛋白胨0.5 g，葡萄糖0.5 g，K2HPO40.5 g，完全溶解于100 mL蒸餾水中后，分裝試管，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。枸櫞酸鹽瓊脂：硫酸鎂0.2 g，磷酸二氫銨1.0 g，磷酸氫二鉀1.0 g，枸櫞酸鈉2.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂20 g，1%溴麝香草酚藍酒精溶液10 mL，蒸餾水1 000 mL。除溴麝香草酚藍酒精溶液外，其他成分混合于蒸餾水中，加熱溶解，調整pH值為7.0，再加入溴麝香草酚藍酒精溶液，混勻后121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，擺成斜面。培養基呈淡綠色。草酸銨結晶紫：取結晶紫飽和溶液(13.87 g結晶紫溶于100 mL 95%酒精)2 mL，加蒸餾水18 mL稀釋10倍，再加入1%草酸銨水溶液80 mL，混合過濾。革蘭碘液：碘化鉀2 g置乳缽中，加蒸餾水約5 mL，再加碘粒1 g，研磨，并徐徐加水至完全溶解后注入棕色瓶中，補加蒸餾水至300 mL。沙黃：將沙黃飽和溶液(3.41 g沙黃溶于100 mL 95%酒精)用蒸餾水稀釋10倍。吲哚試劑：對位二氨基苯甲醛1 g，溶于無水乙醇95 mL后加入濃鹽酸20 mL，避光保存。M-R試劑：甲基紅0.02 g，95%酒精60 mL，蒸餾水40 mL。V-P試劑：甲液：α-萘酚酒精溶液(α-萘酚5 g，無水乙醇100 mL)；乙液：40%KOH溶液(KOH 40 g，蒸餾水100 mL)。0.5%石炭酸生理鹽水：石炭酸0.5 g，蒸餾水100 mL。

1.4 主要儀器設備 超凈工作臺(中國蚌埠計劃設備廠)；電熱恒溫培養箱(中國龍口市先科儀器公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海通用核子儀器廠)；顯微鏡(日本OLYMPUS)；游標卡尺、培養皿以及實驗室常用玻璃儀器等。

1.5 方法

1.5.1 細菌分離培養及形態學觀察 將采集到的病料直接涂片鏡檢和分離培養。直接涂片，若觀察到革蘭陰性無芽孢短桿菌可作為初步診斷；將病料取出，分別接種于麥康凱培養基、伊紅美藍培養基、普通肉湯、普通營養瓊脂培養基上，放在37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，在伊紅美藍瓊脂上長出帶金屬光澤的紫黑色菌落；在麥康凱培養基上長出紅色菌落；在普通培養基上形成中等大小、光滑濕潤、圓形凸起、灰白色邊緣整齊的菌落；普通肉湯中呈均勻渾濁生長，形成菌膜，管底有黏性沉淀。挑取符合特征的單菌落進行革蘭染色，鏡檢，大腸桿菌為革蘭陰性無芽孢短桿菌。

1.5.2 生化試驗[2]用五糖發酵(葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖)、IMViC、三糖鐵試驗進行生化鑒定。按照常規方法用滅菌接種環挑取普通瓊脂斜面上的純培養物少許，進行三糖鐵、五糖發酵、IMViC試驗。本菌能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇產酸產氣，不分解蔗糖；三糖鐵斜面和底部均為黃色，且底部有氣體產生，但不產生H2S；IMViC的試驗結果為++――。

1.5.3 血清型鑒定

(1)抗原制備：先用2 mL 0.5%石炭酸生理鹽水將普通瓊脂斜面小管中的培養物洗下，放到小圓底試管中，制作成濃稠菌懸液，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中121.3 ℃高壓2 h，以破壞其“K”抗原，制得高壓抗原，然后鑒定“O”抗原。

(2)血清型鑒定：加樣：取干凈玻璃板，用蠟筆將其劃成方格，并注明每格相對應的血清標號，每板4種血清，用微量加樣器向每格加一種血清10 μL，再用微量移液器在血清附近滴加一種被檢菌“O”抗原10 μL，但不與血清接觸，用火柴棒將血清與抗原混勻。對照：每次試驗同時以0.5%苯酚生理鹽水和高壓抗原混合物作對照，觀察是否有自凝現象。判定：3 min內出現凝集者為陽性反應。

2 結果

2.1 細菌在不同培養基上的培養特性 大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂上形成帶金屬光澤的紫黑色菌落；在麥康凱瓊脂平板上形成玫瑰紅色中等大小的菌落；在普通瓊脂平板上形成灰白色、濕潤、半透明、邊緣整齊、表面光滑的中等大小菌落；在普通肉湯中呈均勻渾濁生長，有菌膜、管底有黏性沉淀；革蘭染色鏡檢可見多數散在排列的兩端鈍圓的短桿菌，呈粉紅色，為革蘭陰性菌。共分離到150株菌株。

2.2 生化試驗結果 將分離到150株菌株按照常規方法采用五糖發酵、三糖鐵、IMViC試驗，進行生化鑒定，結果見表1。

表1 150株大腸桿菌的生化鑒定結果

+：陽性；-：陰性；A：產酸

2.3 血清型鑒定結果 用玻板凝集法對150株大腸桿菌進行“O”血清型鑒定，結果見表2。

所分離的150株大腸桿菌中，有16株未定性，2株出現玻板凝集或自凝現象，其他132株分離的“O”型血清共有16種；血清型鑒定結果為，O78血清型的菌株最多，共計45株，占菌株的30.0%，O24a、O111和O5分別為12.7%、9.3%和8.0%，為優勢血清型。

表2 150株大腸桿菌的血清型鑒定結果

3 討論

大腸桿菌的不同血清型之間交叉保護率低，不同地區大腸桿菌的血清型種類繁多而且差異較大，為雞大腸桿菌病的防治帶來了較大的困難。在雞大腸桿菌病傳統的流行病學研究中，血清型鑒定占有重要地位，對于由不同血清型大腸桿菌所導致的疾病，血清學分型具有更加重要的指導意義；明確山東省大腸桿菌血清型的分布和不同血清型之間的交叉保護力，對于山東省雞大腸桿菌病疫苗的研制和預防具有重要意義。

本試驗結果顯示，山東省肉雞大腸桿菌的優勢血清型是O78、O24a、O111和O5，分別占鑒定菌株的30.0%、12.6%、9.3%和8.0%。國外有很多關于大腸桿菌血清型鑒定的報道，不同地區流行的優勢血清型所占的比例差異非常大，但最常見的優勢血清型通常是O78[4]。本次試驗分離所得的4個優勢血清型中O78也是常見血清型，而O24a、O5卻不在此列，特別是我們在不同養雞場分離到的19株O24a血清型的大腸桿菌，在其他地區未見報道，這可能與當地引種范圍較廣有關，因此有必要對其進行進一步研究。本次試驗未發現O93、O88、O76、O35、O25、O20、O14、O11、O8血清型，與李宏娟報道的O26和O88是山東地區優勢血清型不一致[5]。O116、O24b、O21、O15、O9、O7、O2占比例較低。山東省2000年17個地市的養雞場致病性大腸桿菌血清型中，O2、O11、O15、O18、O78、O143最為常見[6]，其結果中只有O78與本試驗相同。

從結果也可看出，山東省雞群大腸桿菌血清型分布復雜，不同地區之間血清型有差異，從同一地區甚至同一雞群分離到的大腸桿菌菌株其血清型也不同。大腸桿菌血清型的組成如此復雜，給養雞生產中該病的防治造成了很大困難。因此，通過篩選地區性免疫原性優良的大腸桿菌菌株制作菌苗，是雞大腸桿菌病免疫預防的基礎。建議雞場最好采用自家滅活苗預防較為可靠。

[1] 姚火春.獸醫微生物學實驗指導[M]. 北京：中國農業出版社，2002.

[2] 沈萍,范秀容,李廣武．微生物學實驗[M].北京:高等教育出版社，2004.

[3] 從佩清. 雞大腸桿菌病地方性致病菌株的分離鑒定及免疫研究[J].吉林農業大學學報，1997，19(3)：72-77.

[4] 張春榮，蘇亞拉圖.我國流行的雞致病性大腸桿菌血清型[J]. 中國動物檢疫，1996，16(1)：2-8.

[5] 李宏娟.雞致病性大腸桿菌耐藥性監測及基因型研究[D].保定：河北農業大學，2008.

[6] 丁伯良，王英珍，李秀麗，等.天津地區雞致病性大腸桿菌血清型分布及其優勢血清型的外膜蛋白型研究[J].動物醫學進展，2003，24(2)：94-96.

R378.2+1

B

0529-6005(2017)09-0038-02

2016-12-05

李偉躍(1968-)，男，副教授，博士，主要從事動物營養與免疫研究，E-mail:zhmy.lizihao@163.com