艾菲提蒙湯對動脈粥樣硬化家兔血管平滑肌遷移和增殖相關(guān)蛋白的影響

海爾尼沙古麗·依明 米熱古麗·卡米力 竇勤 李治建 斯拉甫·艾白

[摘要] 目的 探討艾菲提蒙湯對實(shí)驗(yàn)性動脈粥樣硬化（AS）家兔血管平滑肌遷移和增殖的影響。 方法 48只家兔隨機(jī)分為正常組，模型組，陽性對照組和艾菲提蒙湯高、中、低劑量組，每組8只。正常組給予普通飼料;其余5組飼喂高脂飼料，每日1次，連續(xù)60 d;造模同時給藥，其中模型組灌胃生理鹽水，陽性對照組灌胃辛伐他汀片0.002 g/kg，艾菲提蒙湯低、中、高劑量組分別灌胃3.3、6.5、13.0 g/kg藥液，每日1次，連續(xù)60 d。免疫組化法測定艾菲提蒙湯對AS家兔增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和血小板衍生生長因子（PDGF）的影響，Western blot檢測PCNA蛋白表達(dá)。結(jié)果 正常組可見極少量PCNA陽性細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)可見少量不均勻的棕黃色顆粒狀物;模型組PCNA陽性細(xì)胞百分率高于正常組（P < 0.01）;與模型組比較，艾菲提蒙湯低、中、高劑量組PCNA陽性細(xì)胞百分率低于模型組（P < 0.05或P < 0.01）。正常組可見少量PDGF陽性細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)可見少量不均勻的棕黃色顆粒狀物;模型組PDGF陽性細(xì)胞百分率高于正常組（P < 0.05），艾菲提蒙湯低、高劑量組PDGF陽性細(xì)胞百分率低于模型組（P < 0.05）。模型組PCNA蛋白含量高于正常組（P < 0.05）;陽性對照組、艾菲提蒙湯高劑量組PCNA蛋白含量顯著低于模型組（P < 0.05）。 結(jié)論 艾菲提蒙湯對實(shí)驗(yàn)性AS家兔模型的形成有明顯抑制作用，其機(jī)制與降低血管壁PCNA、PDGF的含量，降低家兔血管壁PCNA蛋白的表達(dá)作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 艾菲提蒙湯;家兔;動脈粥樣硬化;增殖細(xì)胞核抗原;血小板衍生生長因子

[中圖分類號] R543.4 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（b）-0004-04

Effect of Aifeitimeng Tang on vascular smooth cell migration and proliferation-related proteins in rabbits with atherosclerosis

Haiernishaguli·Yiming1，2 ? Mireguli·Kmili3 ? DOU Qin2 ? LI Zhijian2 ? Silafu·Aibai1，2

1.College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi ? 830054， China; 2.Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine， Xinjiang Autonomous Region， Urumqi ? 830049， China; 3.Department of Laboratory， Uighur Medicine Hospital， Xinjiang Autonomous Region， Urumqi ? 830049， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Aifeitimeng Tang on vascular smooth cell migration and proliferation. Methods Forty-eight rabbits were randomly divided into normal group， model group， positive control group and Aifeitimeng Tang high， medium and low dose groups， with 8 rabbits in each group. Normal group was given normal feed. Other 5 groups were fed high-fat diet， once a day for 60 consecutive days. Model group was gavaged with normal saline， Simvastatin Tablets in positive control group were gavaged with 0.002 g/kg and Aifeitimeng Tang was gavaged with low， medium and high dose groups with 3.3， 6.5， 13.0 g/kg， once a day， for 60 consecutive days. Immunohistochemistry was used to determine the effect of Aifeitimeng Tang on proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and platelet derived growth factor （PDGF） in rabbits with AS， PCNA protein expression was detected by Western blot. Results In normal group， a small number of PCNA positive cells were observed， and a small amount of uneven brown-yellow granules were observed in the nucleus. The percentage of PCNA positive cells in model group was higher than that in normal group （P < 0.01）. The percentage of PCNA positive cells in Aifeitimeng Tang high， medium and low dose groups were lower than those in model group （P < 0.05 or P < 0.01）. A small number of PDGF positive cells were observed in normal group， and a small amount of uneven brown-yellow granules were observed in the nucleus. The percentage of PDGF positive cells in model group was higher than that in normal group （P < 0.05）， and the percentage of PDGF positive cells in Aifeitimeng Tang low and high dose groups were lower than those in model group （P < 0.05）. Conclusion Aifeitimeng Tang has a significant inhibitory effect on the formation of experimental rabbits model of AS， and its mechanism is related to the decrease of PCNA and PDGF content in the vascular wall and the decrease of PCNA protein expression in the vascular wall of rabbits.

[Key words] Aifeitimeng Tang; Rabbits; Athemsclerosis; Proliferating cell nuclear antigen; Platelet derived growth factor

艾菲提蒙湯是維醫(yī)常用制劑，由合果藤、牛舌草、菊苣子、菟絲草等24味藥材組成，主要用于治療高血壓、高脂血癥等[1]。研究顯示艾菲提蒙湯可顯著降低動脈粥樣硬化（AS）家兔血清總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇水平，改善AS家兔主動脈病理結(jié)構(gòu);明顯降低家兔血清超敏C反應(yīng)蛋白、血管細(xì)胞黏附分子濃度及血管核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB的表達(dá)[2-5]。血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的遷移、增殖是AS形成過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。增殖細(xì)胞抗原（PCNA）和血小板衍生生長因子（PDGF）與VSMC的遷移、增殖密切相關(guān)[7]，是近年AS研究的新靶點(diǎn)。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)建立AS家兔模型，通過預(yù)防性給藥，研究艾菲提蒙湯對AS家兔PDGF和PCNA的影響，Western blot分析PCNA蛋白的表達(dá)水平，深入探討其對AS家兔模型血管平滑肌遷移和增殖影響的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物

艾菲提蒙湯（500 mL/瓶，批號：20150606）由新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院藥劑科制劑中心提供，辛伐他汀片（批號：20151208）購自杭州默沙東制藥有限公司，PCNA免疫組化試劑盒（批號：20150624）、PDGF二抗（批號：20150514）購自美國Invitrogen公司，蛋黃粉（批號：20151203）購自安徽省亳州市紅日蛋制品有限責(zé)任公司，膽固醇（批號：20140527）購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，自制豬油，其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

大耳白家兔48只，雄性，體重1.8～2.2 kg，購自新疆實(shí)驗(yàn)動物研究中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2011-0001，動物合格證號：20160324。飼養(yǎng)環(huán)境及條件：溫度18～28℃，相對濕度40%～70%。照明時間：人工光照12 h明暗周期，每日清掃動物房，每周定期采用84消毒液或過氧乙酸進(jìn)行擦拭消毒，動物房操作人員每日記錄檢疫室和動物實(shí)驗(yàn)室的溫度、濕度、地面消毒信息。本研究經(jīng)新疆維吾爾醫(yī)學(xué)研究院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）;低溫高速離心機(jī)（美國Beckman CoulterTM公司）;GL-88B漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;Chemiscope 3000化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）;Mini-PROTEAN Tetra system蛋白轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）;DYCZ-24DN電泳儀（北京六一生物科技有限公司）;TS-3D脫色搖床（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 家兔AS動物模型建立及藥物干預(yù) 48只雄性家兔，單籠飼養(yǎng)，普通飼料飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組，模型組，陽性對照組和艾菲提蒙湯高、中、低劑量組，每組8只。模型建立采用文獻(xiàn)[8]方法，正常組給予普通飼料，模型組，陽性對照組和艾菲提蒙湯高、中、低劑量組給予高脂飼料（76%普通飼料+8%豬油+0.8%膽固醇+15%蛋黃粉）75 g/d，共60 d。造模開始后，模型組灌胃生理鹽水、陽性對照組灌胃辛伐他汀片0.002 g/kg，艾菲提蒙湯低、中、高劑量組分別灌胃3.3、6.5、13.0 g/kg，每日1次，連續(xù)60 d。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束取血后處死動物，迅速取出主動脈弓部約1 cm，放入凍存管中，液氮保存，用于Western blot檢測。主動脈弓部以下約1 cm用10%中性甲醛溶液固定，模型組病理可見局部粥樣灶形成，粥樣灶形成周圍見肉芽組織形成和淋巴細(xì)胞浸潤，中膜平滑肌局部輕度增生，外膜未見明顯異常，證實(shí)模型成功[4]，然后進(jìn)行免疫組化法測定。

1.4.2 免疫組化法測定家兔PCNA和PDGF陽性細(xì)胞含量 ?包埋組織4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化;5%牛血清白蛋白封閉，加相應(yīng)一抗40 μL，濕盒中4℃過夜;37℃恢復(fù)30 min，加二抗50 μL，濕盒中37℃孵育30 min;二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染5 min，自來水沖洗后鹽酸酒精分化2 s，自來水沖洗10 min，碳酸鋰溶液或磷酸鹽緩沖液（PBS）返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，進(jìn)行免疫組化法測定。按文獻(xiàn)[5]方法對顯微鏡5個視野下陽性細(xì)胞記數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)百分率=1個視野下陽性細(xì)胞數(shù)/該視野下細(xì)胞總數(shù)，每只動物的陽性細(xì)胞數(shù)百分率為5個視野下的陽性細(xì)胞百分率的平均值。

1.4.3 Western blot檢測家兔主動脈PCNA蛋白表達(dá) ?取約100 mg主動脈組織加入200 μL RIPA裂解液，4℃放置60 min后，12 000 r/min離心15 min，離心半徑8 cm，取上清，BCA法蛋白定量，電泳后，考馬斯亮藍(lán)染色90 min。洗脫液洗3次，10 min/次，漂洗過夜，加入適量5×SDS-PAGE loading buffer，沸水加熱處理5 min，12 000 r/min離心5min，取上清，Western blot檢測PCNA蛋白表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊，組間兩兩比較采用Tamhane′s T2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 艾菲提蒙湯對AS家兔血管組織中PCNA、PDGF陽性細(xì)胞含量的影響

正常組可見極少量PCNA陽性細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)可見少量不均勻的棕黃色顆粒狀物;模型組PCNA陽性細(xì)胞百分率高于正常組（P < 0.01）;艾菲提蒙湯低、中、高劑量組PCNA陽性細(xì)胞百分率低于模型組（P < 0.05或P < 0.01）。見表1、圖1（封三）。

正常組可見少量PDGF陽性細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)可見少量不均勻的棕黃色顆粒狀物;模型組PDGF陽性細(xì)胞百分率高于正常組（P < 0.05），艾菲提蒙湯低、高劑量組PDGF陽性細(xì)胞百分率低于模型組（P < 0.05）。見表1、圖2（封三）。

表1 ? 艾菲提蒙湯對動脈粥樣硬化家兔主動脈PCNA、PDGF的影響（x±s，n = 8）

注：與正常組比較，#P < 0.05，##P < 0.01;與模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。PCNA：增殖細(xì)胞核抗原;PDGF：血小板衍生生長因子

2.2 艾菲提蒙湯對AS家兔血管PCNA蛋白含量的影響

模型組PCNA蛋白含量高于正常組（P < 0.05）;陽性對照組、艾菲提蒙湯高劑量組PCNA蛋白含量顯著低于模型組（P < 0.05）。見圖3。

A：正常組;B：模型組;C：陽性對照組;D：艾菲提蒙湯低劑量組;E：艾菲提蒙湯中劑量組;F：艾菲提蒙湯高劑量組。與正常組比較，#P < 0.05;與模型組比較，*P < 0.05。PCNA：增殖細(xì)胞核抗原

圖3 ? 艾菲提蒙湯對AS家兔血管PCNA蛋白含量的影響（n = 8）

3 討論

AS是一種慢性炎癥性疾病[10]，是心血管疾病的病理基礎(chǔ)，可導(dǎo)致急慢性心血管疾病[11-12]。早期AS與內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)代謝異常和血流動力學(xué)損害相關(guān)[13-19]。并且AS的過程伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）流動介導(dǎo)的炎癥改變。EC被激活后，細(xì)胞間黏附分子1、血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）和其他炎性因子表達(dá);大量低密度脂蛋白（LDL）被修飾為氧化LDL（oxLDL），并在血管內(nèi)壁積聚，促進(jìn)AS斑塊的形成[20-21]。研究顯示[2-5]，艾菲提蒙湯可明顯降低家兔血清中超敏C反應(yīng)蛋白、血管細(xì)胞間黏附因子的濃度，降低血管NF-κB的表達(dá)。PDGF亦是炎性反應(yīng)中的重要因子，在缺氧或血管壁損傷等因素的刺激下，ECs、巨噬細(xì)胞中的PDGF釋放增加，同時，PDGF是一種重要的促細(xì)胞分裂劑，可刺激多種細(xì)胞分裂和增殖，如成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等[22]。在AS的發(fā)展過程中，PDGF在VSMC遷移和增殖中起主要作用，盡管在健康和患病血管中均檢測到PDGF的mRNA，但僅在患病血管中發(fā)現(xiàn)VSMC的遷移和增殖。PCNA是一種酸性蛋白質(zhì)，存在于細(xì)胞核內(nèi)，對細(xì)胞分裂及增殖起重要作用，其是DNA復(fù)制和修復(fù)過程中必不可少的輔助蛋白。血管壁PCNA的表達(dá)可反應(yīng)血管細(xì)胞增殖活性的途徑[23]。

綜上所述，艾菲提蒙湯可通過抑制家兔PCNA和PDGF而預(yù)防AS發(fā)生。

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（收稿日期：2019-09-30 ?本文編輯：劉明玉）