厄他培南耐藥腸桿菌科細菌碳青酶烯基因分析與耐藥傳遞機制研究

蘇小燕，羅云俐，葉 濤，何云燕

(重慶市人民醫院檢驗科 400013)

厄他培南耐藥腸桿菌科細菌碳青酶烯基因分析與耐藥傳遞機制研究

蘇小燕，羅云俐，葉 濤，何云燕△

(重慶市人民醫院檢驗科 400013)

目的研究重慶某三級醫院對厄他培南不敏感腸桿菌科細菌所攜帶的碳青酶烯耐藥基因類型及耐藥傳遞方式。方法對臨床分離出的厄他培南不敏感腸桿菌科細菌采用改良Hodge試驗檢測碳青霉烯酶產生情況；PCR擴增常見耐藥基因并測序確定碳青酶烯酶基因；質粒結合試驗研究耐藥基因的傳播方式。結果在臨床772株腸桿菌科細菌中分離出14株對厄他培南不敏感菌株(耐藥12株，中介2株)。13株改良Hodge試驗陽性，其中12株攜帶blaOXA基因，9株攜帶blaIMP基因，2株攜帶blaKPC基因；首次發現同時攜帶blaOXA-1、blaIMP-8和blaKPC-2 3種耐藥基因的陰溝腸桿菌，改良Hodge試驗陰性的1株陰溝腸桿菌沒有檢測出耐藥基因，且該菌株質粒結合試驗失敗。結論該院分離的厄他培南不敏感的腸桿菌科細菌所攜帶耐藥基因以blaIMP-8和blaOXA-1為主，且主要通過質粒傳播。

細菌，抗藥性；腸桿菌科細菌；厄他培南；質粒

腸桿菌科細菌是引起醫院感染最常見病原體。由于產超廣譜β內酰胺酶和AmpC酶菌株的高分離率，碳青酶烯類藥物成為治療耐藥腸桿菌感染的首選[1-3]。但隨著碳青酶烯類藥物的廣泛應用，腸桿菌科細菌對其耐藥已明顯升高，給臨床抗感染治療帶來挑戰[4]。產碳青霉烯酶是該類細菌耐藥的最主要的因素之一。厄他培南是美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)推薦的腸桿菌科細菌碳青霉烯酶的篩選藥物，本研究對2013年10月至2015年3月本院臨床分離的厄他培南不敏感的腸肝科細菌所攜帶的碳青霉烯酶基因種類和耐藥基因傳遞方式進行研究，為本院碳青酶烯類耐藥的腸桿菌科細菌感染的預防和治療提供依據。

1 材料與方法

1.1菌株來源 2013年10月至2015年3月本院所有臨床標本中分離出對厄他培南耐藥或中介[最小抑菌濃度(MIC)>4]的腸肝科細菌14株，包括8株陰溝腸桿菌和6株大腸埃希菌。分別來自骨科(4株)、ICU病房(3株)、呼吸科(2株)、泌尿科(2株)、普外科(2株)、心胸外科(1株)，標本種類為傷口分泌物(5株)、痰液(3株)、尿液(3株)、血液(1株)、膽汁(1株)和引流液(1株)。所收集菌株均排除同一患者來源的相同菌株。

1.2試劑與儀器 Vitek2 Compact全自動細菌鑒定和藥敏系統(法國生物梅里埃公司)；MH瓊脂(杭州天和公司)；Taq DNA聚合酶、DNA Marker、6×loading buffer上樣緩沖液(大連寶生物公司)；引物合成(上海英俊公司)；PCR擴增儀、紫外凝膠成像儀(成都百樂科技公司)。

1.3方法

1.3.1細菌鑒定與藥敏試驗 根據CLSI制訂的微生物臨床檢驗標準及操作規程進行標本采集、接種和培養，用Vitek2 Compact系統對菌株進行鑒定和藥敏檢測，結果解釋參照2014版CLSI M100-S24標準[5]。

1.3.2改良Hodge試驗篩選產碳青霉烯酶菌株 按藥敏試驗操作規程，將調成0.5麥氏當量的大腸埃希菌ATCC 25922細菌稀釋液稀釋10倍后，均勻涂布于MH平板上，室溫待干。將厄他培南藥敏紙片(每片10 μg)貼于MH平板中間。用無菌接種環取適量待測菌、陽性對照菌及陰性對照菌，自紙片外緣向平板邊緣劃直線，35 ℃過夜孵育后觀察結果。在中央抑菌圈內出現明顯矢狀生長者為產碳青霉烯酶菌株。

1.3.3耐藥菌DNA模板的制備 取過夜震蕩培養的菌液1.5 mL，6 000 r/min 4 ℃離心5 min，棄上清液；加750 μL去離子水重懸沉淀，6 000 r/min 4 ℃離心5 min，棄上清液；加300 μL去離子水重懸沉淀，95 ℃ 水浴10 min，冰上速冷2 min；12 000 r/min 4 ℃離心2 min，取上清液200 μL即為所需DNA模板，-20 ℃保存備用。

1.3.4耐藥基因的檢測 PCR總反應體積為25 μL，包括Primer Buffer 12.5 μL，上下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，待測菌的DNA模板1 μL，去離子水10.5 μL。引物序列及參考文獻見表1，擴增條件和結果觀測如來源文獻所述。陽性擴增產物測序后，用NCBI網站中的BLAST程序進行比對，確認具體基因型。

1.3.5質粒結合試驗 以分離的14株臨床菌株為供體菌，EC600為受體菌，分別取供體菌和受體菌過夜培養菌液200 μL和100 μL混合于600 μL的LB肉湯中，37 ℃靜置孵育18 h。接合子接種于含利福平700 μg/mL和厄他培南0.5 μg/mL的選擇培養基上，24～48 h后觀察，有菌落生長者即為結合成功，并同時以供體菌和受體菌在同一培養基內做陰性對照。

2 結 果

2.1藥敏試驗結果 臨床分離的14株細菌，對厄他培南中介2株，包含大腸埃希菌和陰溝腸桿菌各1株，其余12株菌均對厄他培南耐藥。

2.2改良Hodge試驗結果 本研究分離的14株耐藥菌中，13株改良Hodge試驗陽性，1株陰溝腸桿菌為陰性。

2.3耐藥基因檢測結果 14株耐藥菌中，13株細菌攜帶常見耐藥基因。其中12株攜帶blaOXA-1基因，8株攜帶blaIMP-8基因，2株攜帶blaKPC-2基因，1株攜帶blaIMP-26基因。1株陰溝腸桿菌不攜帶所擴增的常見耐藥基因。見表2。

2.4質粒結合和消除試驗 除骨科病房分離的1株陰溝腸桿菌外，其余13株細菌質粒結合試驗均成功。

表1 耐藥基因引物序列

表2 14株腸桿菌科細菌來源及其耐藥基因擴增結果

3 討 論

碳青霉烯類抗菌藥物在臨床上被認為是治療多重耐藥菌感染的最佳選擇，但伴隨此類藥物的大量應用，世界各地陸續發現耐碳青霉烯類的腸桿菌科細菌[2]。本研究共檢測臨床菌株772株，對厄他培南不敏感14株，分離率是1.81%，低于同期我國耐藥監測網顯示全國1.9%的耐藥率，高于重慶1.5%的耐藥率。

產碳青霉烯酶是腸桿菌科細菌對碳青霉烯耐藥的主要原因。碳青霉烯酶包括Ambler分類中的A、B、D 3類[7]。A類是絲氨酸蛋白酶，主要包含blaSME和blaKPC。B類為金屬酶，主要包含blaIMP和blaVIM。D類又稱為OXA酶。本研究對14株耐藥菌進行常見耐藥基因擴增和測序，發現blaOXA-1和blaIMP-8是存在于本院耐藥菌中的主要耐藥基因,這與楊勇文等[8]報道的腸桿菌科細菌中主要流行的是blaOXA-48不同。blaKPC基因最常見于克雷伯菌屬，河南鄭州地區報道過攜帶blaKPC-2的肺炎克雷伯菌和日溝維腸桿菌[9],攜帶blaKPC-2的陰溝腸桿菌目前少見報道。同時攜帶blaOXA-1，blaIMP-8和blaKPC-2 3種耐藥基因的陰溝腸桿菌國內亦未見報道。14株耐藥菌有13株質粒結合試驗成功，表明本院耐藥基因可以通過質粒傳播。

本研究中，來自普外科的兩株陰溝腸桿菌攜帶相同耐藥基因，經進一步核實，兩株菌的分離時間相差兩周，其攜帶者存在同時住院的情況，所以不能排除醫院感染的可能性。骨科分泌物中分離的兩株大腸埃希菌同時攜帶blaOXA-1，但其分離時間間隔8個月，第1株耐藥菌攜帶者出院5個月后，第2株耐藥菌攜帶者才入院，可以排除醫院感染。

本研究還發現1株改良Hodge陰性的陰溝腸桿菌，耐藥基因擴增結果亦為陰性，初步推斷，可能是由于產ESBLs或Amp C酶等其他因素造成。該菌株質粒結合試驗失敗，考慮耐藥基因可能是垂直傳播或通過整合子的方式水平傳播，有待進一步確定。

[1]Queenan AM,Torres-Viera C,Gold HS,et al.SME-type carbapenem-hydrolyzing class A beta-lactamases from geographically diverse Serratia marcescens strains[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(11):3035-3039.

[2]Jones CH,Tuckman M,Keeney D,et al.Characterization and sequence analysis of extended-spectrum-{beta}-lactamase-encoding genes from Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae,and Proteus mirabilis isolates collected during tigecycline phase 3 clinical trials[J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53(2):465-475.

[3]Qi C,Malczynski M,Parker M,et al.Characterization of genetic diversity of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clinical strains collected from 2004 to 2007[J].J Clin Microbiol,2008,46(3):1106-1109.

[4]Harris P,Paterson D,Rogers B.Facing the challenge of multidrug-resistant gram-negative bacilli in Australia[J].Med J Aust,2015,202(5):243-247.

[5]Clinlcal and Laboratory Standards Institute.Performance standaras for antimicrobial susceptibility testing;twenty-fourth informational supplement M100-S24[S].Wayne,PA:CLSI,2014.

[6]Tsakris A,Pournaras S,Woodford N,et al.Outbreak of Infections Caused by Pseudomonas aeruginosa Producing VIM-1 Carbapenemase in Greece[J].Clin Microbiol,2000,38(3):1290-1292.

[7]Queenan AM,Bush K.Carbapenemases:the versatile beta-lactamases[J].Clin Microbiol Rev,2007,20(3):440-458.

[8]楊勇文，李從榮．耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌耐藥基因研究進展[J]．山東醫藥，2016，56(2)：96-98．

[9]許俊紅，王中全．質粒介導的KPC-2型碳青霉烯酶水平傳播機制的探討[J]．醫藥論壇雜志，2013，34(1)：87-88．

蘇小燕(1985-)，碩士，主要從事細菌耐藥性及感染預防方面的研究。△

，E-mail:1210427994@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.032

R378.2

B

1671-8348(2017)28-3981-03

2017-04-15

2017-06-16)