鮑曼不動桿菌外膜囊泡的提取、純化及活性檢測*

張佳星,何云燕,孔春歡,高 睿

(重慶市人民醫院檢驗科 400014)

·經驗交流· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.026

鮑曼不動桿菌外膜囊泡的提取、純化及活性檢測*

張佳星,何云燕△,孔春歡,高 睿

(重慶市人民醫院檢驗科 400014)

目的提取并純化鮑曼不動桿菌(AB)標準株ATCC17978的外膜囊泡(omv)，觀察其形態、結構并檢測其活性。方法常規培養鮑曼標準株，Optiprep密度梯度超速離心提取并純化其omv，經負染電鏡檢測omv形態；BCA法檢測omv總蛋白濃度，SDS-PAGE分析蛋白相對分子質量大小；用純化的omv和蛋白酶K處理后的omv分別刺激人肺癌上皮細胞A549，同時用設不加omv的A549細胞做對照，酶鏈免疫吸附(ELISA)法檢測炎性因子白細胞介素(IL)-8表達水平。結果鮑曼不動桿菌分泌的omv為10～200 nm的球狀囊泡結構；其含有的總蛋白濃度為43.2 mg/mL；ELISA結果提示，鮑曼不動桿菌分泌的omv可刺激A549細胞產生炎性因子IL-8,且產生水平與omv劑量呈正比。結論純化的鮑曼不動桿菌的omv為10～200 nm的雙層囊泡結構，內含多種毒力蛋白，能刺激人肺癌上皮細胞A549產生IL-8。

鮑曼不動桿菌；外膜囊泡；負染電鏡；白細胞介素-8

外膜囊泡(out membrane vesicle,omv)為細菌在自然生長過程中細胞壁向外突出而分泌的雙層膜囊泡狀結構的毒力因子，近年來國外關于細菌omv的產生、特征及免疫調節作用的報道日益增多，尤其是銅綠假單胞菌和大腸桿菌的omv在已有了廣泛的研究[1]。目前已知的大多數革蘭陰性菌均能分泌omv，且分泌的omv含有細菌的大部分毒力因子，如脂多糖(LPS)、細菌細胞膜和周質中的蛋白、溶菌酶及DNA等[2-3]。omv對細菌的作用多種多樣，包括調節細菌的應激反應，選擇性吞飲和分泌毒力因子，參與細菌生物膜的形成，幫助細菌獲得耐藥性，調節宿主的免疫應答等[3-5]。Wispelwey等[6]用腦膜炎模型證實了B型流感嗜血桿菌的omv能幫助細菌滲透血腦屏障，然而，國內外對于人類常見條件致病菌鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii,AB)的omv的研究較少。本實驗提取并純化了AB的omv，觀察其形態、結構并檢測其活性。

1 材料與方法

1.1菌株及細胞 AB標準菌株ATCC17978由本院中山院區檢驗科提供；A549細胞由重慶醫科大學附屬第一醫院提供。

1.2主要試劑與儀器 Optiripe梯度離心液、蛋白酶K均購自Sigma公司；肉湯培養基、BCA法蛋白濃度定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；超濾離心管購至Minipore公司；醋酸雙氧鈾由重慶醫科大學生命科學院電鏡室提供；ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1鮑曼不動桿菌標準株的培養 將-70 ℃凍存的ATCC17978菌株50 uL接種于哥倫比亞血平板，37 ℃、8% CO2孵育24 h；轉種至10 mL LB肉湯培養基中，37 ℃搖床培養16 h；用1 L肉湯繼續培養至A600為1.0。

1.3.2omv的提取 將培養至對數生長期的菌液10 000×g離心10 min，收集上清，用0.22 μm的濾菌器過濾，用截留相對分子質量約100 000的超濾離心管濃縮至原體積的1/6，收集液體，39 000×g離心60 min，棄去上清，將沉淀重懸于180 μL 50 mmol/L的 hepes緩沖液(4-羥乙基哌嗪乙磺酸，N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸，pH 6.8)中，為粗提取的omv。

1.3.3omv的純化 將粗提取的omv加入到6 mL超速離心管底部，從下至上分別加入以下密度的OptiPrep梯度離心液：1.5 mL 50%、1 mL 45%、1 mL 40%、1 mL 35%、1 mL 30%及1.5 mL 25% (OptiPrep/50 mmol/L、HEPES-150 mmol/L NaCl)，4 ℃ 100 000×g離心16 h，從上至下取0.5 mL液體，用50 mmol/L HEPES-150 mmol/L、NaCl稀釋10倍，低溫超速離心4 ℃ 150 000×g 離心1 h，沉淀重懸于50 mmol/L Hepes中，即為純化的AB的omv，置4 ℃保存。

1.3.4AB omv的電鏡觀察 取純化的AB OMV樣品，分別滴加到碳包覆銅網上，滴加2%醋酸雙氧鈾，室溫干燥，并送重慶醫科大學電鏡室進行檢測。

1.3.5蛋白酶K處理omv 將50 μg純化的omv與100 μg/mL蛋白酶K 37 ℃共同孵育30 min，150 000×g離心30 min，沉淀重懸于無菌PBS后，按上述條件再次離心，重復3次，以除去多余的蛋白酶K。置4 ℃保存。

1.3.6omv蛋白的鑒定 BCA法蛋白濃度定量試劑盒說明書測定AB omv的總蛋白濃度。

1.3.7IL-8表達水平的檢測 將A549細胞于含10%熱滅活的胎牛血清(FCS)的DMEM中培養。取對數生長期細胞,經胰酶/EDTA消化,接種于96孔細胞培養板，5×104個孔，于37 ℃、5% CO2的培養箱培養過夜，當細胞達80%～90%融合時,更換新鮮培養基，分別加入純化的omv和蛋白酶K處理后的omv(2～4 μg),并用不加omv的細胞做對照37 ℃孵育24 h，采用ELISA法檢測IL-8。將對照組和實驗組的A549細胞上清每孔100 μL加至酶標板內，酶標板第一排分別加濃度為15.625～1 000 pg/mL的標準品，每孔100 μL，36 ℃孵育90 min，洗滌液洗板5次，對照孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加生物素化抗體工作液(每孔100 μL)，36 ℃孵育60 min，洗板5次，對照孔加酶結合物稀釋液，其余孔加酶結合物工作液(每孔100 μL)，36 ℃避光孵育30 min。洗板5次，加入顯色底物(每孔100 μL)36 ℃避光孵育15 min，加入終止液混用后測量450 nm處的光密度值(OD值)，以標準孔的OD值得為橫坐標，對應IL-8濃度為縱坐標，做標準曲線，根據標準曲線計算實驗組和對照組中的IL-8的表達量。

2 結 果

2.1AB omv的鑒定 電鏡觀察顯示。純化的鮑曼不動桿菌的omv為10～200 nm的雙層囊泡狀結構。見圖1。

圖1 AB omv的電鏡觀察 (×135 000)

2.2AB omv蛋白濃度的鑒定 AB omv的蛋白濃度為38.2 μg/mL。15%SDS-PAGE分析顯示，AB的omv含有多種蛋白，與蛋白酶K處理前omv相比，電泳條帶差異并不明顯，見圖2。證明AB的omv所含有的蛋白大多數位于omv的腔內而非表面。

1：純化AB的omv；2：蛋白酶K處理后的AB omv；M:蛋白質marker
圖2 SDS-PAGE檢測AB omv中的蛋白

*：P<0.05
圖3蛋白酶K處理前后的omv刺激A549細胞產生IL-8水平

2.3IL-8表達水平 ELISA檢測結果顯示，與對照組相比，omv能顯著刺激A549細胞釋放炎性因子IL-8(P1=0.010 109，P2=0.013 641)，與蛋白酶處理前的omv相比，蛋白酶K處理后的omv刺激A549細胞產生IL-8的表達水平并無顯著下降(P=0.613 157)，說明omv誘導上皮細胞產生炎性應答的蛋白主要位于omv腔內。見圖3。

3 討 論

外膜囊泡作為細菌的一個新型毒力因子已成為國內外的研究熱點，Bauman等[7]提取了銅綠假單胞菌標準株PAO1和臨床株的omv，證實了二者的omv均能引起細胞炎癥反應且臨床株的omv引起的炎癥反應更強。Yonezawa等[8]發現幽門螺旋桿菌的omv能增強生物膜的形成能力，從而增強細菌的致病性。Kahn等[9]研究發現，流感嗜血桿菌分泌的omv能幫助細菌之間DNA的傳遞。Norheim1等[10]研究證實，腦膜炎奈瑟菌的omv幫助機體有效地預防腦膜炎，為開發安全可靠的腦膜炎奈瑟菌疫苗提供了依據。

AB和銅綠假單胞菌都是人類常見的條件致病菌，臨床工作中發現在ICU患者的痰液中同時檢測出對碳青霉烯耐藥的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌，說明二者同時感染時，耐藥譜更廣，對患者的治療更為棘手。

本實驗采用肉湯體外常規培養AB至對數期，負染電鏡觀察其產生omv過程，與已經報道的銅綠假單胞菌一樣，AB在自然生長過程中細胞壁向外突出分泌omv[11]；電泳分析顯示，AB的omv包含相對分子質量10～200 000不等的蛋白質，對比電泳結果提示AB的omv所含的蛋白質大部分位于omv的內部，因而只有少部分被表面的蛋白酶K所消化，進一步說明omv與AB的毒力相關。為了證實AB的omv能引起上皮細胞炎癥應答，本文用純化的AB的omv和蛋白酶K處理后的omv分別與A549細胞共同孵育，同時用不加OMV的A549細胞作為對照，24 h后ELISA檢測IL-8表達水平，結果發現純化的omv對A549細胞釋放IL-8具有明顯的刺激作用，隨著omv劑量的增加，IL-8的水平相應增加，與用蛋白酶K處理后的對照組相比，IL-8的表達水平并無顯著差異，說明AB omv內部所含有的蛋白能刺激A549細胞產生炎癥因子IL-8，進一步說明AB的omv可作為炎癥刺激因子引發宿主細胞產生炎癥應答。

本文對鮑曼不動桿菌omv的形態、結構及毒力進行了初步探討，為預防和控制鮑曼不動桿菌引起機體炎癥反應和炎癥損傷提供新的思路。

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重慶市衛生和計劃生育委員會基金資助項目(2016MSXM062)。

張佳星(1988-)，碩士，主要從事鮑曼不動桿菌的毒力及耐藥性研究。△

，E-mail：1210427994@qq.com。

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1671-8348(2017)28-3968-03

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