尿微量清蛋白抗原再添加檢測技術與前帶檢查研究分析*

張杰良，黃雪珍，莫和國，鄧文成，梁映亮，徐灼均，徐 寧

(南方醫科大學附屬小欖醫院檢驗科,廣東中山 528415)

·經驗交流· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.024

尿微量清蛋白抗原再添加檢測技術與前帶檢查研究分析*

張杰良，黃雪珍△，莫和國，鄧文成，梁映亮，徐灼均，徐 寧

(南方醫科大學附屬小欖醫院檢驗科,廣東中山 528415)

目的探討尿微量清蛋白(mALB)抗原再添加檢測與前帶檢查技術應用，識別并消除反應體系中存在的鉤狀效應。方法選擇mALB濃度分別為3.03、1 152.20、2 031.20、3 539.60 mg/L的門診患者隨機新鮮尿液標本4份，選取濃度為3.03 mg/L與1 152.20 mg/L兩份標本，按照不同的稀釋比例，配制成系列稀釋濃度標本12份，加上述兩高值標本組成14份高低系列濃度標本；在全自動生化分析儀上設置前帶檢查報警參數，使用抗原再添加技術檢測14份標本中mALB，觀察并記錄理論濃度值、反應過程吸光度值、實測濃度值與前帶檢查值；通過對出現前帶報警前后標本濃度進行系列再稀釋，查找出現前帶報警的最低濃度值。結果系列稀釋濃度標本中，低濃度標本1至標本5沒有前帶檢查報警，而高濃度標本6至標本14都有前帶檢查報警，而出現前帶檢查報警的最低濃度值為360.74 mg/L。結論mALB檢測方法對高濃度標本存在明顯的鉤狀效應，應用抗原再添加檢測與前帶檢查技術能夠迅速、有效地識別反應體系中的鉤狀效應，并通過儀器自動稀釋再檢測功能正確測定標本濃度。

尿微量清蛋白；抗原再添加技術；前帶檢查；鉤狀效應

免疫濁度分析是利用抗原與相應抗體反應后形成免疫復合物，通過介質濁度產生的變化，定量檢測標本中抗原或抗體濃度的方法，其在臨床檢驗醫學技術方面應用極為廣泛，如免疫球蛋白、特種蛋白、補體、尿液蛋白等物質的檢測；該方法是一種抗原抗體結合動態測定方法，具有敏感、特異、簡便快速等特點，可用于自動化及大批量檢測[1]；然而，此方法對于低濃度標本的檢測結果比較好，但對于高濃度標本可能會出現“鉤狀效應(Hook Effect)”[2]，即由于抗原或抗體過量，使抗原抗體比例不合適而導致檢測結果呈弱陽性或假陰性的現象。本研究應用抗原再添加檢測與前帶檢查技術，通過對系列高低濃度的尿微量清蛋白(mALB)進行免疫比濁定量檢測，研究分析不同濃度標本反應吸光度與實測濃度的變化，同時根據反應監測曲線形狀與前帶檢查(Prozone Check)報警值，識別并消除反應體系中存在鉤狀效應。

1 材料與方法

1.1標本來源 選擇門診患者新鮮隨機尿液4份，經檢測，mALB濃度分別為3.03、1 152.20、2 031.20、3 539.60 mg/L。

1.2儀器與試劑 采用Roche Cobas C8000全自動生化分析儀進行樣品檢測；mALB檢測試劑(R1、R2)，mALB抗原過剩檢測試劑(R3)及配套校準品與質控品均由Roche公司提供。

1.3方法

1.3.1檢測原理 mALB采用的是抗原再添加的檢測方法,即抗清蛋白抗體與樣品中清蛋白反應產生抗原/抗體復合物并形成濁度，在抗體適當過量的情況下，吸光度隨著濁度增加而增加，反應曲線方向上升；隨后加入一定量稀釋的清蛋白(抗原過剩檢測試劑)，如反應曲線方向繼續上升，說明抗體過剩，如反應曲線方向轉為下降，說明抗原過剩。根據反應監測曲線吸光度的前后變化可計算出標本mALB濃度與判斷是否發生鉤狀效應。

1.3.2檢測參數 mALB檢測方法采用2點終點法，主/次波長為340 nm/700 nm，整個檢測過程時間10 min，儀器共測定并記錄38個吸光度點測定值并生成反應監測時間與吸光度反應曲線圖；其中試劑R1、R2、R3添加時間分別于第0、8、19點；用于標本吸光度及濃度計算的為第6點吸光度(A6)與第14點吸光度(A14)值，而用于前帶檢查(PC)的吸光度為第18點吸光度(A18)與第26點吸光度(A26)值，前帶檢查(PC)吸光度區間下限為“-32 000”,上限為“700”，如果PC值落在上下限之間,則前帶報警“>Proz”。以上所有檢測參數由Roche公司提供。

1.3.3標本吸光度與前帶檢查值計算[3]標本吸光度：Ax=A14-dx×A6,dx=(Vsamp+VR1)/(Vsamp+VR1+VR2),Cx=b×[(a-Ax)/(Ax-d)]1/c；前帶檢查值：dx=(Vsamp+VR1+VR2)/(Vsamp+VR1+VR2+VR3),PC=A26-dx×A18。Ax為待測標本吸光度計算值，dx為稀釋因子，Cx為待測標本濃度,Vsamp與VR1、VR2、VR3為反應過程樣品與各試劑體積，a、b、c、d分別為mALB校準曲線參數(S1Abs,K,A,B),PC為前帶檢查值。本文Cx與PC由儀器自動計算并記錄。

1.3.4系列稀釋濃度標本配制與測定 按照以下稀釋系列“1 L,0.95 L+0.05 H,0.9 L+0.1 H,0.8 L+0.2 H,0.7 L+0.3 H,0.6 L+0.4 H,0.5 L+0.5 H,0.4 L+0.6 H,0.3 L+0.7 H,0.2 L+0.8 H,0.1 L+0.9 H,1H”，用低濃度標本3.03 mg/L(L)對高濃度標本1 152.20 mg/L(H)進行稀釋，將系列稀釋濃度標本與濃度為2 031.20、3 539.60 mg/L兩高值標本進行編號(標本1、標本2……標本14)并在儀器上檢測，計算系列標本理論濃度，記錄儀器反應過程吸光度值與實測濃度值。根據發生前帶檢查報警(>proz)前后(標本5與標本6)的標本濃度，再采用上述的低濃度標本(L)與高濃度標本(H)配制(標本5與標本6濃度區間)系列稀釋濃度標本，稀釋系列為(μL)：345L+135H、345L+140H、345L+145H、345L+150H、345 L+155 H、345 L+160 H、345 L+165 H、345 L+175 H，標本編號：標本21、標本22……標本28。記錄儀器反應過程吸光度值及實測濃度值。

表1 mALB系列稀釋標本濃度檢測值與前帶檢查值表

2 結 果

2.1mALB系列稀釋標本理論濃度值、吸光度值、實測濃度值及對應前帶檢查(PC)值結果 PC值在區間“-32 000，700”之內的，顯示前帶檢查報警“>Proz”。見表1。

2.2前帶報警前后再稀釋系列標本濃度檢測結果 標本21、標本22……標本28的檢測濃度及對應的PC值分別為：327.39 mg/L(982)、337.28 mg/L (871)、345.24 mg/L (829)、355.52 mg/L (787)、360.74 mg/L (665,>Proz)、369.64 mg/L (394,>Proz)、375.00 mg/L (383,>Proz)與396.75 mg/L (141,>Proz)。

圖1 mALB理論濃度值與吸光度計算值及實測濃度值關系變化圖

2.3mALB系列稀釋標本理論濃度值與吸光度計算值及實測濃度值的變化關系 mALB系列稀釋標本理論濃度值與吸光度計算值及實測濃度值的變化關系見圖1。隨著標本mALB濃度(理論濃度)的增高，儀器測定吸光度值及Ax也在升高，一直到標本10(922.21 mg/L)達到峰值；此后的高濃度標本11(1 037.10 mg/L)至標本14(3 539.60 mg/L)，測定吸光度值及Ax反而在下降，其中濃度最高的標本14下降最多，其吸光度計算值Ax只有1 247.3，介乎于低濃度標本1(3.03 mg/L)與標本2(60.63 mg/L)的Ax之間，呈明顯的假性低值。mALB系列稀釋標本反應過程吸光度變化較為典型的6個反應監測曲線見圖2。反應曲線監測點6之前(標本與試劑1混合后)，高低濃度標本吸光度變化相差不大；監測點14之前(標本與試劑1,2混合后)抗原與抗體反應形成免疫復合物，產生濁度，在一定范圍內標本濃度越高，吸光度越高，通過監測點A6與A14吸光度變化可根據公式計算待檢標本濃度。

3 討 論

鉤狀效應是免疫比濁分析中很常見的現象，如腎病綜合征患者尿液中mALB的檢測(出現弱陽性或假陰性結果)，能否正確識別與消除反應體系中存在的鉤狀效應，直接關系到待測標本結果準確性，進而影響臨床診斷與治療[4]。

根據表1和圖1理論濃度、標本Ax與儀器記錄的實測濃度Cx之間不成比例的變化關系可知，mALB檢測方法對高劑量標本存在明顯的鉤狀效應。表1與圖1還顯示，標本10的濃度值為系列稀釋濃度拐點(標本吸光度與實測濃度由增長轉向下降)，從而可能會誤認此標本濃度為出現鉤狀效應的拐點，但從PC值可知，標本6的濃度值(462.62 mg/L)已出現前帶檢查報警(>Proz)，一直持續到標本14；也就是說，標本6到標本10之間雖然反應仍為正反應，但已出現鉤狀效應(理論濃度與實測濃度不成比例增加)，而出現鉤狀效應的濃度點應是在標本5(347.72 mg/L)與標本6濃度之間。根據前帶報警前后濃度再稀釋系列標本檢測結果，mALB檢測方法出現前帶檢查報警的最低濃度值為360.74 mg/L，即標本濃度大于或等于此值的檢測結果可能存在鉤狀效應。上述結果說明，通過在分析儀器設置前帶檢查參數可迅速、有效識別反應體系中存在的鉤狀效應[5]。需要注意的是，本實驗所用的mALB檢測試劑盒的使用說明書上注明的方法檢測范圍為3～400 mg/L，其上限值比本實驗前帶報警值要高。也就是說，檢測值在達到方法檢測范圍上限前可能已存在鉤狀效應，因此對檢測結果進行解釋或進行方法性能驗證時要注意鑒別。

通過圖2可知，如反應體系中有抗體過剩，加入抗原過剩檢測試劑(試劑3)后，濁度增加，吸光度繼續上升；如反應體系中抗體已消耗完(抗原過量)，加入抗原過剩檢測試劑后，濁度增加不明顯，甚至下降，導致吸光度下降，通過吸光度點A18與A26監測加入抗原過剩檢測試劑前后吸光度變化，并計算前帶檢查值判斷是否出現前帶報警。從圖2可直觀看出，高低濃度標本反應監測曲線整體呈現明顯不同變化，以標本2的反應曲線為參考曲線來看，隨著標本濃度的增高，反應曲線向上移動，標本10的反應曲線達到最高點；此后，隨著標本濃度繼續升高，其反應監測曲線卻向下移動，這種現象的出現是由于標本濃度越高，抗原抗體比例越失衡，反應完成率就越低造成的。標本14(3 539.60 mg/L)可能是由于反應一開始抗體就被消耗完成，抗原抗體比例嚴重失衡，各監測點吸光度均處于低水平，其整個反應監測曲線呈一低平曲線。由此可知，正確認識與理解反應監測曲線的吸光度前后變化特點，是鑒別鉤狀效應是否存在的基礎[6]。

免疫比濁中高劑量鉤狀效應識別可以從檢測系統的試劑、儀器、方法等各環節著手。有研究報道通過反應完成率設置儀器參數與試劑或樣品二次添加觀察時間反應進程曲線的變化，可有效識別反應體系中存在的鉤狀效應[6-7]，但該方法無法給出直觀明了的報警參數，并且操作繁瑣，不容易理解。騰曉梅[8]通過對超過檢測方法線性范圍的標本進行手工稀釋或儀器自動稀釋再檢測的方法能較好地識別鉤狀效應，但本文結果已表明，在標本濃度達到線性范圍階限前可能已存在鉤狀效應。上述學者文獻結果顯示，在全自動生化分析儀器上設置合適的檢測參數對標本進行監測，是監測反應體系中鉤狀效應存在的有效方法，但都無法準確、直觀快速地解決反應體系中鉤狀效應。本實驗的mALB檢測方法應用抗原再添加與前帶檢查技術，通過觀察反應監測曲線的變化及反應過程有無前帶檢查報警，能夠迅速、準確地測定標本中的mALB濃度，并能有效識別反應體系中存在的鉤狀效應。如識別反應體系存在有鉤狀效應，則可以通過儀器上的自動稀釋功能對標本進行稀釋重測或采用手工合理稀釋后正確測定標本中分析物濃度。

高劑量鉤狀效應不僅存在于免疫比濁分析中,在電化學發光免疫[9]、酶免疫測定[10]等所有以抗原抗體反應為基礎、以吸光度分析為手段的臨床檢驗方法中也普遍存在。因此，作為臨床實驗室工作者應該高度重視抗原抗體檢測中高劑量鉤狀效應對分析結果的影響，盡量識別并消除反應體系中存在的鉤狀效應，切實提高檢測結果的準確性,為臨床提供可靠的診斷數據。

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廣東省中山市醫學科研基金資助項目(2016J154)。

張杰良(1982-)，主管技師，本科，主要從事臨床生化檢驗工作?！?/p>

,E-mail:769137702@qq.com。

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1671-8348(2017)28-3962-03

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