穩定eIF1過表達的鼻咽癌細胞株的構建及其功能研究*

梁馨云，趙 毅#，黎銀潮，李湛豪，曾慧玲，王 燕△

(廣東醫科大學：1.基礎醫學院；2.第二臨床醫學院，廣東東莞 523808)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.003

穩定eIF1過表達的鼻咽癌細胞株的構建及其功能研究*

梁馨云1，趙 毅1#，黎銀潮2，李湛豪2，曾慧玲2，王 燕1△

(廣東醫科大學：1.基礎醫學院；2.第二臨床醫學院，廣東東莞 523808)

目的構建穩定真核翻譯起始因子1(eIF1)過表達的鼻咽癌細胞株，研究其對鼻咽癌細胞增殖和遷徙活性的影響。方法采用pEGFP-C1真核表達系統，構建eIF1過表達載體，轉染鼻咽癌CNE1細胞，進而獲得穩定轉染細胞株CNE1-eIF1及其對照細胞，以實時熒光定量PCR(qPCR)和蛋白質印跡法(Western blot)驗證該細胞中eIF1的過表達情況。采用細胞增殖與遷徙實驗分別檢測CNE1-eIF1細胞增殖和遷徙活性。結果酶切電泳鑒定及測序檢測顯示pEGFP-C1-eIF1真核表達載體構建成功。穩定eIF1過表達的鼻咽癌CNE1細胞CNE1-eIF1的eIF1基因和蛋白的表達水平與空載質粒轉染相比分別增加2.85倍和2.58倍(P<0.05)，而其增殖和遷徙活性組分別下調55%和36%(P<0.05)。結論成功構建eIF1過表達鼻咽癌細胞株，eIF1過表達可顯著下調鼻咽癌細胞的增殖和遷徙活性，提示其具有潛在的抑癌作用。

鼻咽腫瘤；穩定細胞株；EIF1；基因轉染；真核翻譯因子

真核翻譯起始因子1(eukaryotic initiation factor1，eIF1)是該家族中最早被命名的成員，其蛋白相對分子質量約12×103，基因位于17q21.2區[1-2]。eIF1因被發現能夠以其不同的蛋白質表面區域結合40S核糖體亞基、eIF2、eIF3及eIF5等，參與組裝43S翻譯前起始復合物，高保真掃描并選擇翻譯起始密碼子而備受關注[3-4]。隨著對eIF4E、eIF5A等家族成員的功能進一步研究，特別是在細胞發育、腫瘤發生與轉移等進程中的作用不斷引發研究熱潮[5-6]，針對該家族其他成員的研究探索逐漸成為研究熱點[7-8]。本研究通過體外基因克隆技術，構建了過表達eIF1的鼻咽癌細胞株及陰性轉染對照細胞[9]，進而就過表達eIF1對鼻咽癌細胞增殖和遷徙活性的影響進行了研究，以期為探討真核翻譯調控機制對腫瘤發生、發展的影響提供重要的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 真核表達載體pEGFP-C1及鼻咽癌CNE1細胞為廣東醫科大學科研實驗中心保存提供，大腸桿菌感受態細胞DH5α購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.2試劑與引物 高純度質粒小提中量試劑盒(DP107)、DNA Marker購自天根生化科技(北京)有限公司；2×Power Taq Plus PCR MasterMix(PR4001)購自北京百泰克生物技術有限公司；限制性核酸內切酶HindIII/BamHI、RNAiso Plus(9108)及PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)購自寶生物工程(大連)有限公司；Lipofectamine?3000 Transfection Reagent(L3000008)購自Thermo Fisher Scientific公司；FastStart Universal SYBR Green Master(ROX，04913850001)購自羅氏(中國)公司；Anti-eIF1單克隆抗體(ab118979)、Anti-β Actin單克隆抗體(ab8226)購自Abcam公司；RIPA Lysis Buffer System(sc-364162)、BCA Protein Assay Kit(sc-202389)、Western Blotting Luminol Reagent(sc-2048)及HRP標記羊抗鼠二抗(sc-2005)購自Santa Cruz公司。CCK8檢測試劑盒(CA1210)購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室(3422)購自Corning公司。eIF1的Real-time PCR引物，上游：5′-TGT AAC CAT TTG GGG TCC GCT T-3′，下游：5′-TTT GTA ATC TTA GGG CTC TGG GCTT-3′。內參GAPDH的Real-time PCR引物，上游：5′-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3′，下游：5′-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3′。

1.2方法

1.2.1質粒構建與鑒定 以Genbank中eIF1的mRNA序列(NM_005801.3)為模板，pEGFP-C1載體為基礎，構建eIF1過表達載體，插入序列兩端攜帶限制性核酸內切酶HindⅢ/BamHⅠ的靶序列。以測序、PCR鑒定及酶切電泳驗證插入序列及過表達載體構建情況。

1.2.2細胞培養 將鼻咽癌CNE1細胞于含10%FBS的DMEM培養液中，在37 ℃、5%CO2培養箱中飽和濕度、常規培養。分別設置常規培養組(Blank組)、過表達質粒轉染組(CNE1-eIF1組)、空載質粒轉染組(CNE1-NC組)及陰性轉染對照組(Control組)，每組3復孔。

1.2.3細胞轉染 參照說明書，采用Lipofectamine?3000 Transfection Reagent以試劑盒參考比例轉染質粒DNA入鼻咽癌CNE1細胞中，轉染后12 h換液。轉染后24～48 h觀察細胞熒光表達情況，計算轉染效率，經預實驗驗證，以轉染后48 h熒光表達為鑒定細胞轉染效率的依據。

1.2.4穩定過表達細胞株篩選及鑒定 轉染后48 h，以含有G418(800 μg/mL)的DMEM培養基稀釋細胞，而后挑取單克隆加壓篩選2個月，3～4 d更換含有G418(終濃度400 μg/mL)的DMEM培養液1次篩選培養，待細胞數穩定增長后，挑取單克隆細胞簇進行RNA及蛋白水平鑒定，其中RNA檢測采用實時熒光定量PCR(qPCR)，嚴格按試劑盒說明書操作，采用寶生物工程(大連)有限公司RNAiso plus試劑盒提取細胞總RNA，以PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA，并用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)進行檢測。蛋白檢測采用蛋白質印跡法(Western blot)，參照說明書，以RIPA Lysis Buffer System試劑盒提取細胞總蛋白，以BCA Protein Assay Kit對總蛋白定量，而后以50 μg總蛋白及蛋白Marker上樣，采用12% SDS/PAGE電泳，PVDF膜轉印，特異性一抗4 ℃撫育過夜，以Western Blotting Luminol Reagent檢測。留取與對照組相比，eIF1過表達水平最高的1株細胞株，即為CNE1-eIF1過表達細胞，同時結合熒光表達鑒定法構建空載體轉染對照細胞株CNE1-NC細胞。

1.2.5細胞增殖實驗 選用CCK8細胞增殖檢測試劑盒，取對數生長期各組細胞以每孔3 000個分別接種于96孔細胞培養板中，細胞接種后12 h，設置重復孔，其后嚴格按照試劑盒說明書操作，BioTek公司Synergy 2多功能酶標儀450 nm波長測每孔吸光度(A)值。與對照組相比，計算細胞增殖比率。

1.2.6細胞遷徙實驗 采用Corning公司Transwell小室，取對數生長期細胞，按每毫升5×105個細胞濃度加入200 μL無血清細胞懸液到小室中，下室中加入含10%FBS和1%纖維粘連蛋白的完全培養基500 μL，設置3復孔，繼續培養48 h后，取出Transwell小室用PBS 輕輕洗2遍，用棉簽去除上室膜表面的細胞。甲醇固定30 min，0.1%結晶紫室溫下染色30 min，PBS洗3遍使結晶紫完全沖干凈，在高倍鏡視野下計數穿膜細胞數，取交叉十字共10 個視野，計算平均值。與對照組相比，計算細胞遷移比率。

2 結 果

2.1質粒酶切電泳及測序結果 如圖1所示，可見環狀質粒DNA被切斷后呈現線性條帶改變。證明質粒構建插入內切酶HindⅢ及BamHⅠ的酶切位點正確可靠。雙向測通，pEGFP-C1-eIF1載體MCS(Multiple cloning site)區插入序列與擬構建的eIF1表達序列一致,見圖2。

1:pEFGP-C1-eIF1載體;2:pEGFP-C1-eIF1載體經HindⅢ酶切后形成的線性DNA;3:pEGFP-C1-eIF1載體經BamHⅠ酶切后形成的線性DNA
圖1 pEGFP-C1-eIF1質粒酶切電泳圖

圖2 pEFGP-C1-eIF1插入序列測序峰

2.2細胞轉染情況 與Blank組、Control組相比，CNE1-eIF1組、CNE1-NC組細胞均出現大量明顯的綠色熒光，計數200個細胞，兩組細胞均顯示轉染效率為90%以上，說明轉染成功，外源GFP綠色熒光蛋白表達正常。見圖3。

2.3eIF1過表達鑒定 Blank組和CNE1-NC組細胞eIF1基因、蛋白的表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；與CNE1-NC組相比，CNE1-eIF1組細胞的eIF1 mRNA、蛋白的表達水平分別上調2.85倍、2.58倍(P<0.05)。見圖4、5。

2.4eIF1過表達對鼻咽癌細胞增殖和遷徙活性的影響 Blank組和CNE1-NC組細胞增殖、遷移活性比較差異無統計學意義(P>0.05)；與CNE1-NC組相比，CNE1-eIF1組細胞的增殖、遷移活性分別下調55%、36%(P<0.05)。見圖6。

圖3 細胞轉染24 h熒光表達

A：內參基因GAPDH及目的基因eIF1的溶解曲線圖；B：3組細胞eIF1 mRNA相對表達量
圖4 eIF1穩定轉染細胞株eIF1 mRNA表達水平

β-actin：內參基因GAPDH；eIF1：目的基因
圖5 eIF1穩定轉染細胞株eIF1蛋白表達水平

A：增殖；B：遷徙
圖6過表達eIF1對鼻咽癌CNE1細胞的增殖和遷徙活性的影響

3 討 論

作為真核翻譯起始因子家族成員中第1個與擬表達基因mRNA起始區域結合的成分，eIF1對于選擇并掃描相關基因mRNA自5′帽子結構區至起始密碼子AUG序列前，進而控制翻譯起始的保真性與延續性等過程至關重要[3]。Lind等[1]研究發現，eIF1與eIF1A一起通過控制翻譯起始階段，針對mRNA起始密碼第1位和第3位堿基配對的識別與自由能的調控，升高錯配自由能需求，進而保真調節核糖體tRNA識別結合mRNA起始密碼子的掃描過程。另外，在密碼子與反密碼子沒有正確配對時，eIF1可以抑制GTP的水解，控制AUG上下游堿基序列的配對，調控翻譯起始過程。當密碼子的識別完成后，eIF1 的抑制作用被減弱，經由精確的起始密碼子及其上下游堿基的配對eIF1的抑制作用得以減弱[10]，從而啟動翻譯起始復合物的合成。有研究發現，蛋白翻譯起始時40 S核糖體亞基上面的mRNA結合通道為關閉狀態，當eIF1和eIF1A先后結合到亞基上面時，特別是eIF1 結合到40 S核糖體亞基P位點后，其mRNA結合通道才得以打開，擬表達基因的mRNA結合到核糖體亞基上，核糖體tRNA開始沿mRNA的5′端進行掃描，識別AUG起始密碼子及其上下游堿基序列，堿基配對無誤后，eIF1 從核糖體亞基上釋放出來，翻譯起始復合物開始形成， mRNA結合通道關閉，蛋白翻譯起始[11-12]。在此過程中，特別是在核糖體完成與擬表達基因mRNA起始密碼子識別后，eIF1的存在對翻譯前起始復合物的形成，GTP水解和能量釋放,乃至蛋白翻譯過程的抑制作用，不容忽視[13]。

目前，隨著真核翻譯起始家族成員在多種人類疾病，尤其是腫瘤相關疾病中的研究日漸深入，如eIF4E、eIF5A等在乳腺癌、大腸癌和鼻咽癌等多種腫瘤中的促癌作用已成為相關研究熱點[14-15]，作為啟動真核蛋白翻譯起始的關鍵分子，eIF1在腫瘤發生、發展進程中的作用亟待進一步的研究。為研究eIF1在鼻咽癌發生、發展中作用，本研究成功構建了eIF1真核表達載體，轉染至鼻咽癌CNE1細胞中，篩選并成功構建了過表達eIF1的鼻咽癌CNE1-eIF1細胞及其對照陰性CNE1-NC細胞，從而為進一步探討蛋白翻譯起始調控在癌基因表達和腫瘤形成、復發、轉移中的影響提供了研究工具。在此基礎上,筆者就eIF1對鼻咽癌細胞增殖和遷徙活性的影響進行了初步的探索，結合文獻研究，筆者發現過表達的eIF1可明顯下調鼻咽癌細胞的增殖和遷徙活性，提示eIF1在鼻咽癌CNE1細胞的蛋白翻譯起始過程中具有重要的調控作用，其對CNE1細胞翻譯起始復合物的形成和真核細胞蛋白翻譯的啟動可能具有重要的開關抑制作用，并可由此影響到細胞的一系列生物學行為，對腫瘤細胞可能具有潛在的抑癌作用。

目前國內外雖已有多家研究機構致力于此方面的相關研究，但均無明確的突破，本研究的發現為真核細胞蛋白翻譯的機制研究和腫瘤癌基因異常表達的調控研究提示了研究方向，為進一步的探討eIF1影響鼻咽癌病變轉移機制奠定了一定的基礎。

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StudyonconstructionandfunctionofCNE1cellsstablyover-expressingeIF1gene*

LiangXinyun1,ZhaoYi1#,LiYinchao2,LiZhanhao2,ZengHuiling2,WangYan1△

(1.BasicMedicalCollege;2.SecondClinicalMedicalCollege,GuangdongMedicalUniversity,Dongguan,Guangdong523808,China)

ObjectiveTo establish nasopharyngeal carcinoma cell line (CNE1) with eIF1 gene stable over-expression and to study its effects on the proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells.MethodsEIF1 over-expression vector was constructed by adopting the pEGFPC1 eukaryotic expression system for transfecting nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells.Thus the stably transfected EIF1-elF1 and its control cells were obtained.The over-expression situation of eIF1 in these cells was verified by real time fluorescence quantitative PCR(qPCR) and Western blot.The proliferation and migration activity of CNE1-eIF1 cells were tested by adopting the cell proliferation and migration tests.ResultsThe enzyme digestion electrophoresis identification and sequencing showed that the pEGFPC1-eIF1 eukaryotic expression vector was successfully constructed.After mRNA and protein expression identification,compared with the reloading plasmid transfection group,the eIF1 gene mRNA and protein expression levels in nasopharyngeal carcinoma cell line CNE1 stably over-expressing elF1 were up-regulated by 2.85 folds and 2.58 folds respectively (P<0.05),while its proliferation and migration activities were down-regulated by 55% and 36% respective (P<0.05).ConclusionThe nasopharyngeal carcinoma cell line over-expressing elF1 is successfully constructed,the eIF 1 over-expression could significantly down-regulate the proliferation and migration activities of nasopharyngeal carcinoma cells,suggesting that eIF1 has potential anti-tumor effect.

nasopharyngeal neoplasms;stable cell lines;EIF1;gene transfection;eukaryotic translation factor

廣東省自然科學基金資助項目(2015A030310046)；廣東省中醫藥局科研基金資助項目(20151261)；廣東醫科大學國家級大學生創新創業訓練計劃基金資助項目(201510571003)。

梁馨云(1981-)，實驗師，本科，主要從事腫瘤學與病原生物學研究。#共同第一作者趙毅(1978-)，副教授，博士，主要從事腫瘤免疫學研究。△

，E-mail：657057106@qq.com。

R73-35

A

1671-8348(2017)28-3896-04

2017-04-18

2017-06-06)