基質金屬蛋白酶-8對角膜基質膠原的作用研究*

金 鑫,劉素素,賀司宇,王麗婭,張芬芬,代閆芳,楊 柯,張晊瑞,張紅敏△

（1.鄭州大學人民醫院眼科/河南省眼科研究所/河南省立眼科醫院，鄭州 450000；2.錦州醫科大學眼科學碩士研究生，遼寧錦州 121000；3.新鄉醫學院眼科學碩士研究生，河南新鄉 453000）

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.30.004

基質金屬蛋白酶-8對角膜基質膠原的作用研究*

金 鑫1,劉素素1,賀司宇1,王麗婭1,張芬芬2,代閆芳1,楊 柯1,張晊瑞3,張紅敏1△

（1.鄭州大學人民醫院眼科/河南省眼科研究所/河南省立眼科醫院，鄭州 450000；2.錦州醫科大學眼科學碩士研究生，遼寧錦州 121000；3.新鄉醫學院眼科學碩士研究生，河南新鄉 453000）

目的探討基質金屬蛋白酶-8（MMP-8）對角膜的作用。方法選取健康C57BL/6J小鼠15只，右眼角膜基質內注射10 μL MMP-8作為實驗組，左眼給予等量生理鹽水作為對照組。于0、4、8 h使用雙光子顯微鏡二次諧波成像技術對活體小鼠角膜逐層掃描，Imaris軟件對所得圖像三維重建，計算圖像信號強度。4、8 h在裂隙燈下評價角膜混濁度。8 h角膜取材，測定各角膜羥脯氨酸水平。結果0 h實驗組及對照組小鼠角膜基質纖維信號強度分別為89.7±11.2、85.3±7.0，4 h分別為14.5±3.4、46.6±14.0，8 h分別為11.0±4.6、34.6±12.5，4 h及8 h，實驗組較對照組角膜基質信號強度明顯降低（P<0.05）；4 h及8 h，實驗組較對照組角膜明顯混濁（P<0.05）；8 h測得實驗組與對照組角膜羥脯氨酸水平分別為（0.433±0.090）、（0.590±0.133）μg/mg，實驗組明顯低于對照組（F=7.193，P=0.014）。結論MMP-8對小鼠角膜基質膠原有明顯的降解破壞作用，導致角膜透明度下降。

角膜基質；基質金屬蛋白酶-8；二次諧波成像

真菌性角膜炎（fungal keratitis，FK）是一種嚴重的致盲性眼病，近年來發病率逐漸升高[1]。國內外學者研究發現，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-8在FK表達升高[2]。MMP-8屬于MMPs中膠原酶的一種，可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原。目前研究認為MMP-2和MMP-9在角膜基質重塑及膠原降解中有重要作用[3]，而MMP-8對角膜的作用及作用機制尚少見研究報道。二次諧波（second harmonic generation,SHG）成像是近年發展起來的一種層面掃描解析組織結構的光學成像技術，具有非線性光學成像特有的三維高分辨率和高成像深度，在生物醫學領域先后應用于角膜、活細胞成像等研究方向[4]。本實驗通過建立小鼠角膜MMP-8基質注射模型，使用SHG實時活體觀察膠原纖維信號強度等，探討MMP-8對小鼠角膜膠原的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 8～12周齡無特殊病原體（SPF）級雄性C57BL/6J小鼠15只，體質量20～25 g，購自南京大學模式動物研究所，經裂隙燈檢查無眼科疾病。實驗小鼠在溫度為（25±1）℃、相對濕度為59%～61%、12 h光照/12 h黑暗的SPF級動物房內飼養，由專人管理。動物的飼養與使用遵照相關的實驗動物倫理要求。

1.1.2主要試劑及儀器 重組鼠MMP-8（rmMMP-8，美國R&D公司）、MMP-8檢測試劑盒（美國AnaSpec公司）、羥脯氨酸試劑盒（南京建成生物工程研究所）、4-乙酸汞基苯胺（AMPA，美國Sigma公司）、酶標儀（美國Perkin Elmer公司）、裂隙燈顯微鏡（日本Topcon公司）、手術顯微鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司）、體視顯微鏡（德國Zeiss公司）、雙光子激光掃描顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.2方法

1.2.1MMP-8活性鑒定 用Assay Buffer配制50 μL 1 ng/μL MMP-8（含1 mmol/L AMPA），37 ℃孵育1 h活化后加入酶板，同時加入50 μL MMP-8 底物；另設50 μL Assay緩沖液加入50 μL MMP-8底物作為單純底物孔，各重復3個復孔，室溫孵育30 min。設置激發光波長340 nm，發射光波長490 nm，酶標儀測吸光度（A）值。

1.2.2角膜基質注射動物模型建立及分組 右眼作為實驗組，用Assay緩沖液配置20 ng/μL MMP-8，37 ℃孵育1 h活化，角膜基質注射方法參照文獻[5]。實驗小鼠按0.017 mL/g腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉。手術顯微鏡下，術者左手輕按小鼠結膜囊以暴露眼球，右手持微量注射器，角膜緣內1 mm處進針，進入角膜中基質層后緩慢注射約10 μL MMP-8。左眼作為對照組按上述方法注射等量生理鹽水。

1.2.3角膜混濁度臨床評分 基質注射前（0 h）及注射后4、8 h在裂隙燈顯微鏡下觀察小鼠角膜混濁度，評分系統如下[6]：角膜完全透明，虹膜紋理清晰可見,計0分；角膜輕度混濁，可見75%及以上虹膜紋理，計1分；角膜基質中度混濁，可見50%～<75%虹膜，計2分；角膜基質重度混濁，僅可見50%以下虹膜，計3分；角膜基質完全混濁，不可透見前房、虹膜及瞳孔，計4分。

1.2.4SHG觀察角膜基質信號強度 將小鼠麻醉平穩后放在特殊制作的固定頭位的平臺上，暴露待測角膜，根據參考文獻[6]設置發射波長780 nm，20倍水浸物鏡觀察，使用Z-stack（Z=5 μm）逐層掃描，于0、4、8 h采集圖像，獲得的圖像用Imaris軟件進行三維重建，計算圖像的平均信號強度。圖像信號強度越強即說明角膜基質膠原纖維排布越規則，角膜基質結構完整，圖像信號越弱即說明角膜基質膠原纖維結構紊亂或被降解[7]。

1.2.5羥脯氨酸試劑盒檢測角膜羥脯氨酸水平 羥脯氨酸為膠原水解產物，測定羥脯氨酸可反映角膜中膠原的水平，操作參照文獻[8]及試劑盒說明書進行，方法如下：8 h后經腹腔麻醉小鼠，脫頸椎法處死，體視顯微鏡下進行角膜取材，測質量（mg）。將角膜放入EP管中剪碎，加入100 μL水解液，95 ℃水浴加熱20 min，調節pH在6.0～6.8，加入1 mL蒸餾水及少量活性碳，混勻離心，取100 μL上清液。配置100 μL 5 μg/mL羥脯氨酸標準品。取100 μL蒸餾水作為空白對照。向空白管、標準品及各樣品中分別加入100 μL 56 mmol/L Chlormine T試劑，室溫孵育25 min，取100 μL上清液，加入100 μL 1 mol/L Ehrlich′s 液，60 ℃水浴15 min，冷卻后，3 500 r/min離心10 min，取上清液200 μL加入96孔板，各設2個復孔，于波長550 nm測定A值。按照公式：（測定A值-空白A值）/（標準A值-空白A值）×標準品濃度×水解液總體積（0.1 mL）/角膜濕重（mg），計算樣品中的羥脯氨酸水平（μg/mg）。

1.3統計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。角膜混濁度比較采用兩獨立樣本資料比較的Wilcoxon秩和檢驗。SHG檢測基質信號強度組間比較采用重復測量方差分析。角膜羥脯氨酸濃度檢測組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1MMP-8活性鑒定 MMP-8平均A值（A490）為206.3±13.9，單純底物孔為34.0±6.6。

2.2角膜混濁度臨床評分的比較 于0、4、8 h使用體視顯微鏡對角膜拍照（圖1）。4 h渾濁度為0分的角膜在實驗組為0只，對照組為11只，渾濁度為1分在實驗組為12只，對照組為4只，渾濁度為2分在實驗組為3只，對照組為0只；8 h渾濁度為0分的角膜在實驗組為0只，對照組為13只，渾濁度為1分在實驗組為4只，對照組為2只，渾濁度為2分在實驗組為11只，對照組為0只。使用Wilcoxon秩和檢驗統計結果，4 h及8 h實驗組與對照組角膜混濁度比較，差異有統計學意義（均P=0.000）。

圖1 體視顯微鏡下小鼠角膜（×16）

2.3SHG觀察基質信號強度 0 h實驗組與對照組角膜基質信號強度分別為89.7±11.2、85.3±7.0；4 h實驗組與對照組分別為14.5±3.4、46.6±14.0；8 h實驗組與對照組分別為11.0±4.6、34.6±12.5。重復測量方差分析統計結果，根據Mauchly球形檢驗，所得數據不符合球形假設（P<0.05），故對數據進行多變量方差分析，各個時間點的數據差異有統計學意義（P<0.01）。各組內不同時間點角膜基質信號強度比較，差異有統計學意義（P<0.05）；實驗組和對照組0 h間比較，差異無統計學意義（P=0.75）；實驗組和對照組間4 h及8 h比較，差異有統計學意義（P=0.000），實驗組角膜基質纖維信號強度較對照組明顯降低。

2.4角膜羥脯氨酸水平測定 8 h角膜取材，實驗組與對照組角膜羥脯氨酸水平分別為（0.433±0.090）、（0.590±0.133）μg/mg，使用單因素方差分析統計數據，經Shapiro-Wilk檢驗證實呈正態分布（P>0.05），組間方差經 Levene 檢驗證實方差齊，實驗組角膜羥脯氨酸水平明顯低于對照組（F=7.193，P=0.014）。

3 討 論

FK是全球范圍內一種嚴重的致盲性眼病，由于共聚焦顯微鏡等早期診斷技術及抗真菌滴眼劑的早期應用，已部分降低真菌性眼內炎的發生率，從而避免眼內容剜除。然而臨床上FK患者由于基質破壞在晚期往往形成瘢痕愈合，若瘢痕位于瞳孔區，甚至致盲[1]。由于角膜供體緊缺，雖然人工角膜及各種角膜替代材料正在研究中，目前仍有相當一部分患者不能夠進行角膜移植，且術后為預防角膜排異反應需長期應用抗排斥滴眼劑，影響患者的生活質量，所以如何防止瘢痕形成已成為近年來FK研究的重要方向。

FK大致發病過程如下，角膜受外傷后，上皮細胞屏障受損，導致基底膜暴露，致病真菌黏附于受損的角膜上皮，引起機體天然免疫和適應性免疫反應。一方面，真菌的病原相關分子結構與宿主角膜上皮細胞的Toll樣受體（TLRs）相互作用，引起角膜上皮細胞分泌白細胞介素（IL）-8等誘導中性粒細胞浸潤；另一方面，真菌表面的β-葡聚糖與角膜居留巨噬細胞表面的Dectin-1結合，導致酪氨酸激酶（Syk）磷酸化、核因子（NF）-κB轉移至核內，NF-κB進入核內進一步引起腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1β、IL-8表達，擴大炎性反應，免疫細胞（主要是中性粒細胞[9]）釋放水解酶，在殺滅真菌的同時對角膜造成破壞[10]。

MMPs分5個亞組，膠原酶、明膠酶、基質水解酶、膜型金屬蛋白酶及廣泛底物酶。其中，MMP-8屬于膠原酶的一種，又名中性粒細胞膠原酶。正常狀態下，MMP-8以酶原的形式存在，然而病理狀態下，如角膜潰瘍[11]、人工角膜移植術后[10]，MMP-8表達迅速升高，當MMPs與基質金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）失衡，可導致角膜基質降解。

本研究通過建立MMP-8高表達模型，以SHG成像技術活體實時觀察角膜基質膠原纖維及混濁度變化，并通過角膜羥脯氨酸的測定，定量觀察角膜膠原水平，闡明了MMP-8可直接降解角膜Ⅰ型膠原，從而造成基質破壞，導致角膜混濁。隨著MMPs/TIMPs在角膜疾病研究的不斷深入，現已研制多種天然及人工合成TIMPs，在角膜炎癥早期使用TIMPs滴眼劑可為角膜瘢痕的治療提供新策略。本研究為TIMPs滴眼劑應用于MMP-8高表達的角膜病以減輕角膜瘢痕提供新思路。

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EffectofMMP-8oncorneacollagen*

JinXin1,LiuSusu1,HeSiyu1,WangLiya1,ZhangFenfen2,DaiYanfang1,YangKe1,ZhangZhirui3,ZhangHongmin1△

（1.DepartmentofOphthalmology,People′sHospitalofZhengzhouUniversity/HenanProvinvcialEyeInstitute/HenanProvinvcialEyeHospital,Zhengzhou,Henan,450000,China;2.DepartmentofOphthalmology,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou,Liaoning121000,China;3.MasterDegreeCandidateofOphthalmology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453000,China）

ObjectiveTo investigate the effect of MMP-8 on cornea.MethodsFifteen C57BL/6J healthy mice were selected.The right eyes corneal stroma was injected by 10μL MMP-8 as the experimental group and the left eyes were injected by same amount of normal saline as the control group.At 0,4,8 h,the two-photon microscope second harmonic generation imaging technology was used to scan mice corneal stroma layer by layer in vivo.The obtained images were performed the 3D reconstruction by Imaris software and the signal intensity of the images were calculated.At 4,8 h,the corneal opacity degree was evaluated under slit lamp.At 8 h,mice were killed and corneas were collected to determine the hydroxyproline concentration.ResultsThe cornea stromal fiber signal strengthes at 0 h in the experimental group and control group were （89.7±11.2） and （85.3±7.0）,which at 4 h were （14.5±3.4） and （46.6±14.0） respectively,which at 8 h were （11.0±4.6） and （34.6±12.5） respectively.The cornea stromal signal strength at 4,8 h in the experiemental group was significantly decreased compared with that in the control group （P<0.05）;the cornea at 4,8 h in the experimental group was significantly turbid than that in the control group （P<0.05）;the cornea hydroxyproline concentrations detected at 8h in the experiemental group and control group were （0.433±0.090） μg/mg and （0.590±0.133） μg/mg respectively,the experimental group was significantly lower than the control group （F=7.193,P=0.014）.ConclusionMMP-8 has obvious degradation and destroy effect on mice corneal stroma collagen,which leads to the decrease of corneal opacity.

corneal matrix;matrix metalloproteinases-8;second harmonic generation

河南省自然科學基金資助項目（162300410163）；河南省創新人才計劃項目（144100510015）；河南省國際合作項目（152102410085）。

金鑫（1991-），住院醫師，碩士，主要從事角膜病的研究。△

，E-mail：zhm0906@163.com。

R392.9

A

1671-8348（2017）30-4187-03

2017-01-18

2017-04-06）