肥胖相關基因與叉頭轉錄因子在非酒精性脂肪肝大鼠模型肝臟中的表達*

陳益耀，陳 軼，何周桃，蔡曼妮

（海南省人民醫院消化內科，海口 570311）

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.30.003

肥胖相關基因與叉頭轉錄因子在非酒精性脂肪肝大鼠模型肝臟中的表達*

陳益耀，陳 軼，何周桃，蔡曼妮

（海南省人民醫院消化內科，海口 570311）

目的研究肥胖相關基因（FTO）與叉頭轉錄因子O1（FoxO1）蛋白在非酒精性脂肪肝模型大鼠肝臟中的表達水平。方法通過飼喂高能量和高脂肪的大鼠飼料制備非酒精性脂肪肝動物模型，然后采集大鼠的血液和肝臟組織，測定其肝臟指數和血液生化指標，包括三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、丙氨酸氨基轉移酶（AST）、天冬氨酸氨基轉移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）；對大鼠進行肝臟病理檢測；采用免疫組織化學法測定FTO蛋白和FoxO1蛋白在大鼠肝臟中的表達水平。結果8周后，模型組大鼠的肝臟質量、體質量和肝臟指數3項指標均高于對照組大鼠，差異有統計學意義（P<0.05）；模型組大鼠的AST、ALT、LDL、ALP、TG和TC均高于對照組大鼠，差異有統計學意義（P<0.05）；模型組大鼠的HDL低于對照組大鼠，差異有統計學意義（P<0.05）；模型組大鼠肝小葉部分產生脂肪變性、炎癥，對照組大鼠則沒有；模型組大鼠的FTO蛋白和FoxO1蛋白在肝臟中的表達積分高于對照組大鼠，差異有統計學意義（P<0.05）。結論FTO與FoxO1一起相互作用，可能擾亂正常的能量和脂肪代謝。

叉頭轉錄因子類；非酒精性脂肪肝；能量代謝；脂類代謝；肥胖相關基因

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）作為一種與遺傳、環境和代謝方式均相關的疾病，其與人體的肥胖程度具有很高的相關性。目前醫學界對NAFLD的具體發病機制仍然沒有完全研究透徹，但是“二次打擊”學說獲得了很大程度的認可。該學說認為胰島素抵抗（IR）和氧化應激分別造成了初次打擊和二次打擊[1]。2007年，Frayling 等[2]發現了一種新型的基因，該基因在人體內分布較為廣泛，并且能夠在很大程度上對人的食欲進行調節，同時對能量的代謝也有很大影響。隨后，Guo等[3]進一步的研究發現，肥胖相關基因（FTO）通過增多丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）氧化應激標志物進而參與到NAFLD的發病機制中，且其自身亦在NAFLD中表達上調，但是這一過程的具體分子水平的機制尚不十分清楚。但已經有研究顯示，FTO可以通過影響人體的肥胖程度參與到NAFLD的發病機制過程中。叉頭轉錄因子（FoxO1）是一個被最早發現的轉錄因子，當人體肝臟細胞發生IR時，其活性得到提高，通過不同的途徑最終可能會導致高血糖癥和高三酰甘油血癥[4]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通過FoxO1來調節肝臟細胞糖異生過程中磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（PEPCK）和葡萄糖-6磷酸酶（G6Pase）這兩種關鍵酶基因的表達，同時AMPK也是FTO調節人體肥胖程度和飲食的中介因子[5]。FTO和FoxO1二者之間的相互作用機制目前尚少見報道，本研究通過制備NAFLD大鼠模型，研究FTO和FoxO1在大鼠肝臟中的表達水平，并對其作用機制進行探究，以期為臨床治療NAFLD提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1動物來源 雄性SD大鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，體質量（200±10）g。

1.2方法

1.2.1NAFLD大鼠模型建立 SD大鼠喂養1周適應環境后，分別抽取15只作為對照組和模型組，對照組大鼠飼喂普通動物飼料，模型組大鼠飼喂特制高能量和高脂肪動物飼料（普通飼料加100 g/kg豬油，加20 g/kg膽固醇，加100 g/kg蔗糖），飼養8周后進行指標測定。

1.2.2大鼠血液采集和肝臟分離 大鼠禁食24 h后，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，斷頭采集血液，25 ℃靜置3 h后，使用離心機以3 000 r/min離心15 min，留取上清液待用。大鼠斷頭處死后快速取出肝臟，計算肝臟指數=肝臟重量（g）/大鼠體質量（g）×100%，然后切下小片放入甲醛溶液進行組織固定，石蠟切塊后進行蘇木精-伊紅（HE）染色，然后觀察。

1.2.3大鼠血清生化檢測 使用全自動生化儀（德國羅氏，Cobas6000）測定大鼠的血清標本，測定指標分別為：三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、丙氨酸氨基轉移酶（AST）、天冬氨酸氨基轉移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）。

1.2.4大鼠肝臟病理切片 挑取大鼠肝臟組織，放入磷酸緩沖液中進行漂洗，漂洗干凈后放入甲醛溶液中進行固定，然后交由醫院病理科進行下一步的大鼠肝臟病理切片（HE染色）。

1.2.5FTO蛋白和FoxO1蛋白表達測定 參照張潔蕾[6]免疫組織化學S-P法對大鼠的FTO蛋白和FoxO1蛋白在肝臟中的表達進行測定。

2 結 果

2.1模型組大鼠與對照組大鼠的肝質量、體質量和肝臟指數比較 8周后，對照組大鼠皮毛光滑整齊，活動靈敏，精神狀態良好，無不良特征，模型組大鼠皮毛特別有光澤，但較為肥胖，行動遲緩，習慣性待在原地打瞌睡。經過8周的喂養，模型組大鼠的肝臟質量、體質量和肝臟指數3項指標均高于對照組大鼠，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 兩組大鼠的肝臟質量、體質量和肝臟指數比較

a：P<0.05，與對照組比較

2.2模型組大鼠與對照組大鼠的血清生化指標比較 經過8周喂養后，模型組大鼠的AST、ALT、LDL和ALP高于對照組，差異有統計學意義（P<0.01）；模型組大鼠的TG和TC也高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；模型組大鼠的HDL低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 兩組大鼠的血清生化指標比較

a：P<0.01，b：P<0.05，與對照組比較

2.3模型組大鼠與對照組大鼠的肝臟組織病理比較 經HE染色法染色后顯示，模型組大鼠肝小葉部分產生很多脂肪變性，有炎癥產生（圖1B）；而對照組大鼠肝小葉部分則沒有脂肪變性，也沒有肝臟細胞產生炎癥（圖1A）。

A：對照組；B:模型組
圖1兩組大鼠的肝臟組織病理切片比較

2.4模型組大鼠與對照組大鼠的FTO蛋白與FoxO1蛋白在肝臟組織的表達比較 選取合適的肝臟組織進行固定、切片，然后經免疫組織化學染色處理，結果顯示模型組大鼠的FTO蛋白和FoxO1蛋白在肝臟中的表達積分（6.57±1.86vs.4.71±1.56）與對照組（1.28±0.49vs.2.67±0.99）相比，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討 論

現代社會隨著生活節奏和飲食結構的變化，脂肪肝的患者數量逐年上升，這其中NAFLD患者占有很高的比例。有研究顯示，人體內的脂肪酸和脂肪酸的代謝物會沉積在肝臟細胞內，可能會導致NAFLD的發病[7-8]。但目前為止，NAFLD的發病機制并沒有完全闡明，因此，也缺乏相應的有效治療藥物和手段，這使得NAFLD對患者的危害極其嚴重，發現NAFLD的發病機制并尋找有效的藥物和治療方法十分重要。

近年來的研究發現，肥胖與人體內血脂升高有緊密的聯系，而肥胖和人體內的血脂升高都會導致NAFLD發病風險的明顯升高[9]。環境和飲食結構對人體的肥胖程度及體內血脂水平影響巨大，但是隨著科學研究的深入，發現人體本身的基因對此也有巨大影響，FTO可以通過調節人對食物的欲望和能量代謝來調節人體的肥胖及血脂水平。同時，該基因還可以在下丘腦、胰島等器官中表達，與許多內科疾病的產生有很大關系[2]。變異后的FTO基因也可導致相關疾病的產生，如2型糖尿病[10]。FTO可以使MDA和SOD這兩種物質在人體內的水平升高，這與NAFLD的發病關系密切，表明FTO在NAFLD的發病機制中具有某種重要作用[3]。FTO在NAFLD患者體內細胞表達升高時，患者體內細胞的脂肪形成和氧化應激水平均會顯著增加[11]。FoxO1活性增高時，可以引起2型糖尿病的發病或人體血脂水平的升高[12]。有研究顯示，當FoxO1在鼠肝臟內過表達時，會使鼠體內游離脂肪酸累積，進而導致肝臟細胞產生脂肪變性[13]。

本研究通過實驗，證實了在模型組大鼠的肝臟中，FTO蛋白和FoxO1蛋白的表達與NAFLD的發病具有緊密聯系，這說明FTO與FoxO1一起相互作用可能擾亂正常的能量和脂肪代謝。

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Expressionofobesity-relatedgeneandforkheadtranscriptionfactorsinliverofnonalcoholicfattyliverdiseaseratmodel*

ChenYiyao,ChenYi,HeZhoutao,CaiManni

（DepartmentofGastroenterology,HainanProvincialPeople′sHospital,Haikou,Hainan570311,China）

ObjectiveTo research the obesity-related gene （FTO） and forkhead transcription factors O1 （FoxO1） protein expression level in the livers of non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD） rat model.MethodsThe animal model of NAFLD in rats was prepared by feeding high energy and high fat feed.Then the rat blood and liver tissue were collected for detecting the liver index and blood biochemical indexes,including triglycerides（TG）,total cholesterol（TC）,alanine aminotransferase（AST）,aspartate aminotransferase（ALT）,alkaline phosphatase（ALP）,high-density lipoprotein （HDL） and low density lipoprotein（LDL）;the liver pathological examination was performed;FTO protein and Fox O1 protein expression levels in rat liver were detected by using the immunohistochemical assay.ResultsThe rat liver weight,body weight and liver index after 8 weeks in the model group were higher than those in the control group,the difference was statistically significant （P<0.05）;the levels of AST,ALT,LDL,ALP,TG and TC in the model group were higher than those in the control group,the difference was statistically significant （P<0.05）,the HDL level in the model group was lower than that in the control group,the difference was statistically significant （P<0.05）;the model group produced steatosis and inflammation in hepatic lobule part,while the control group had no these lesions;the FTO protein and FoxO1 protein expression levels in liver of the model group were higher than those in the control group,the difference was statistically significant （P<0.05）.ConclusionFTO and FoxO1 interaction may disturb the normal energy and fat metabolism.

forkhead transcription factors;nonalcoholic fatty liver disease;energy metabolism；lipid metabolism;obesity related gene

海南省衛生與計劃生育委員會基金資助項目（14A210192）； 海南省自然科學基金資助項目（814310）；海南省中藥現代化專項基金資助項目（2015ZY02）。

陳益耀（1979-），副主任醫師，碩士，主要從事非酒精性脂肪性肝病的基礎與臨床研究。

R322.4

A

1671-8348（2017）30-4185-02

2017-01-30

2017-04-18）