細胞傳代致弱的禽偏肺病毒JC毒株致病性變化的研究

韋 莉 , 王 菁 , 朱珊珊 , 閻 旭 , 全 榮 , 李子璇 , 侯 磊 , 齊賓賓 , 姜海軍 , 劉 爵

(北京市農林科學院畜牧獸醫研究所 畜禽疫病防控技術北京市重點實驗室 ， 北京 海淀 100097)

細胞傳代致弱的禽偏肺病毒JC毒株致病性變化的研究

韋 莉 , 王 菁 , 朱珊珊 , 閻 旭 , 全 榮 , 李子璇 , 侯 磊 , 齊賓賓 , 姜海軍 , 劉 爵

(北京市農林科學院畜牧獸醫研究所 畜禽疫病防控技術北京市重點實驗室 ， 北京 海淀 100097)

將禽偏肺病毒(aMPV)JC株在Vero細胞上傳代傳至第50代時，細胞適應毒株毒價為105.6TCID50/mL；雛雞致病性試驗結果顯示，aMPV JC株細胞傳代第50代與親本毒F0相比感染雛雞發病率降低，病理變化減輕，表明第F50細胞適應毒的毒力減弱。

禽偏肺病毒 JC株 ； 細胞適應病毒 ； 致病性

禽偏肺病毒(avianmetapneumovirus，aMPV)屬于副黏病毒科偏肺病毒屬，能夠引起火雞、雞、鴨以及野鳥等急性呼吸道感染以及產蛋的下降[1]。火雞鼻氣管炎、禽鼻氣管炎和肉雞腫頭綜合征都與該病毒感染有關[2]。根據吸附糖蛋白G的核苷酸序列分析和用單克隆抗體中和試驗，將aMPV分為 A、B、C和D 4個亞型[3]。1978年aMPV感染首先在南非報道[4]，隨后在西班牙、英國、法國、以色列、德國、匈牙利都有該病發生的報道。我國于1998年在有腫頭綜合征的雞群中首次報道分離到禽肺病毒A亞型[5]。之后在山東、黑龍江、吉林、河北、湖北、新疆等地的部分雞場進行aMPV血清學調查，發現我國雞群中普遍存在aMPV感染[6-10]。2012年又陸續報道在雞群中分離到B和C亞型[11-12]。

aMPV可在多種原代細胞內增殖，如雞胚成纖維細胞(CEF)、雞胚肝細胞(CEL)、原代火雞雞胚成纖維細胞(TEF)和來自于鵪鶉成纖維細胞的QT-35細胞。Patnayak等[13]又證明了aMPV也可在多種傳代細胞系中增殖，如黑長尾猴腎細胞(BGM-70)、胎獼猴細胞(MA-104)、非洲綠猴腎細胞(Vero)、雞成纖維細胞(DF-1)、鼠源的McCoy細胞和敘利亞倉鼠腎細胞(BHK-21)等，不同的aMPV毒株對不同細胞的適應性存在差異。

本研究將分離到的禽偏肺病毒C亞型JC株[12]在Vero細胞上連續傳代培養，觀察第50代細胞毒的動物致病性，為禽偏肺病毒細胞適應弱毒苗的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞、抗體和實驗動物 禽偏肺病毒C亞型JC株[12]由本實驗室分離、鑒定并保存。Vero細胞本研究室保存。21日齡SPF雛雞，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.2 試劑和主要儀器 胎牛血清、DMEM培養基干粉、青鏈霉素雙抗、SuperScriptTMⅢ反轉錄酶，均購自Gibco公司；Qiagen RNeasy Mini Kit，購自Qiagen公司。

1.3 禽偏肺病毒在細胞上的傳代培養 Vero細胞長成單層后，用PBS洗2次，將病雞組織研磨液接種于細胞，37C吸附1.5 h，棄吸附液，PBS洗2次，加入1%雙抗和2% FBS的DMEM繼續培養。逐日觀察，培養7 d后，置于-20 ℃，反復凍融3次，作為1代病毒分離物。經過5代盲傳后，出現細胞病變，收集70%～80%病變的細胞。如此反復，在Vero細胞上傳代培養至細胞適應毒株第50代(F50)。

1.4 禽偏肺病毒細胞適應毒對易感SPF雞的致病性 30只21日齡SPF雛雞隨機分為3組，滴鼻點眼分別接種禽偏肺病毒 JC株親代毒株和第50代細胞適應毒株，0.2mL/只，標記為F0和F50組；剩余1組接種PBS，為陰性對照。隔離器中飼養2周，記錄各組的發病情況。采集咽拭子和鼻甲、喉頭、氣管和肺臟等組織，觀察組織病理變化，并提取咽拭子中總RNA，進行RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

2 結果

2.1 禽偏肺病毒在細胞上的適應性生長 將禽偏肺病毒JC株在Vero細胞上連續傳代培養，F1代至F5代，感染細胞未見明顯的細胞病變；F6代以后，出現細胞聚集成團、圓縮、脫落、其間隙增寬等現象。產生的CPE與Cook[2]報道的感染特征基本一致。隨著傳代次數的增加，病毒滴度逐漸升高，F40～F50代病毒的滴度穩定在104.3-4.6TCID50/ 0.1mL。說明aMPV-JC株能夠在Vero細胞上適應性生長。

2.2 aMPV JC株F50對雞的致病性

2.2.1 臨床表現 F0組雛雞在感染后第3天陸續出現打噴嚏、鼻孔有分泌物流出等癥狀；攻毒后第5天，大部分雞只甩頭、打噴嚏，鼻部有半透明的黏液分泌出來(見中插彩版圖1A)。感染后第7天F0組雛雞發病率為100%。F50組感染后第5天1只雛雞出現輕微流涕(見中插彩版圖1B)，發病率為10%。而對照組未見任何臨床癥狀。表明aMPV細胞適應毒F50與其親代毒F0相比，發病率大幅降低。

2.2.2 剖檢變化和病理變化 剖檢發現，F0組中鼻甲有大量分泌物，或有干酪樣物質，氣管有大量黏液；F50組除1只發病雞鼻甲有分泌物和氣管有輕度黏液外，未發病雞只與陰性對照雞只一樣無改變(見中插彩版圖2)。

病理檢查發現F0組鼻甲黏膜增厚，黏膜下血管擴張，充血；氣管黏膜增厚，固有膜內淋巴細胞浸潤；肺泡壁有炎性細胞浸潤，腔內有出血和滲出物；F50組發病雞只出現與F0組病理變化相同，程度略輕，在肺泡腔內未見到出血和滲出物；未發病雞只除氣管黏膜有輕度增厚外與正常對照無明顯差別(見中插彩版圖3)。這些結果進一步說明aMPV細胞適應毒F50與其親代毒F0相比，毒力明顯減弱。

2.2.3 發病雛雞實驗室診斷 利用本實驗室建立的aMPV RT-PCR檢測方法對F0和F50感染的發病雞咽拭子進行病毒檢測，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，在800 bp處出現特異性條帶，與預期aMPV目標條帶大小一致(圖4)，表明F0和F50組的發病雞是由aMPV感染所引起。

圖4 F0和F50感染雞咽拭子病毒RNA檢測M：M:DL-2 000 Marker(bp)； 1: F0； 2:F50； 3:未感染；4:陽性對照； 5：陰性對照

3 討論

禽偏肺病毒是危害世界養禽業的重要疫病之一[2]，也是導致肉雞腫頭綜合征的重要誘因之一[14]。在火雞養殖業，aMPV引起的呼吸道疾病所造成的危害僅次于禽流感病毒，造成巨大的經濟損失[15]，但其對雞的影響卻知之甚少[2]。

本研究通過對細胞適應毒致病性的研究，發現aMPV JC株在Vero細胞連續傳代過程中，隨著傳代次數的增加，病毒滴度逐漸升高；傳至第50代時，病毒滴度達104.6TCID50/0.1mL。用第50代細胞適應毒與其親本毒感染21日齡SPF雞，發現F50代病毒與親本毒相比出現臨床癥狀的雞只大幅度減少，發病率只有10%，且發病雞只病理改變減輕，說明F50與親本毒相比毒力明顯減弱，為今后弱毒苗的研制奠定了基礎。

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PathogenicityChangesofCellAttenuatedAvianMetapneumovirusJCStrain

WEI Li , WANG Jing , ZHU Shan-shan , YAN Xu , QUAN Rong , LI Zi-xuan ,HOU Lei , QI Bin-bin , JIANG Hai-jun ，LIU Jue

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Municipal Academy of Agriculture and Forestry Sciences；Beijing Key Laboratory for Prevention and Control of Infectious Diseases in Livestock and Poultry, Beijing 100097，China)

Avianmetapneumovirus(aMPV) JC strain was propagated in Vero cells. The virus titer reached to 105.6TCID50/mL after 50 passages. Compared to parental virus, the morbidity rate decreased and the pathological changes were alleviated in chicken after being challenged with passage 50 virus. It indicated that the virulence of F50 cell adapted strain was attenuated.

avianmetapneumovirusJC strain ； cell adaptive virus ； pathogenicity

LIU Jue

S852.65 文獻杯志碼：A

0529-6005(2017)09-0006-02

2016-12-15

北京市科技計劃項目(Z141100002314013)；國家現代農業產業技術體系肉雞產業技術體系(CARS-42)

韋莉(1966-)，女，研究員，博士，從事動物病毒學研究,E-mail：w_lyx2008@126.com

劉爵，E-mail:liujue@263.net