豬乙型腦炎病毒GZ0409-31分離株E基因遺傳進化分析

廖潔丹 ， 劉 薇 ， 朱夢嬌 , 趙明秋 ， 陳金頂

(1．佛山科學技術學院生命科學與工程學院 , 廣東 佛山 528231 ， 2．華南農業大學獸醫學院 , 廣東 廣州 510642 ，3．廣東永順生物制藥股份有限公司 , 廣東 廣州 511356)

豬乙型腦炎病毒GZ0409-31分離株E基因遺傳進化分析

廖潔丹1，2， 劉 薇2，3， 朱夢嬌2, 趙明秋2， 陳金頂2

(1．佛山科學技術學院生命科學與工程學院 , 廣東 佛山 528231 ， 2．華南農業大學獸醫學院 , 廣東 廣州 510642 ，3．廣東永順生物制藥股份有限公司 , 廣東 廣州 511356)

本研究采用RT-PCR方法對分離自貴州省發病豬睪丸組織中的流行性乙型腦炎病毒GZ0409-31株的E基因進行克隆和序列測定，利用生物信息學軟件對E基因核苷酸序列和推導的氨基酸序列進行分子遺傳進化關系分析。結果表明，乙型腦炎病毒GZ0409-31毒株與基因Ⅲ型的乙腦病毒毒株屬同一分支，遺傳進化關系較近。

豬 ； 乙型腦炎病毒 ；E基因 ； 遺傳進化分析

日本乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)又稱流行性乙型腦炎，簡稱乙腦，是由日本乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)引起的一種嚴重威脅人獸健康的中樞神經系統性急性傳染病[1-2]。JE具有明顯的季節性和一定的地理分布區域，多發生于蚊蟲較多的夏秋季節，屬于自然疫源性疾病。豬是JEV的重要儲存宿主和增殖宿主，是JE的主要傳染源。JEV主要引起母豬的繁殖障礙，致死率雖不高，但可引起懷孕母豬流產、死胎或木乃伊胎，也可引起公豬辜丸炎或不育。因此，JE仍是嚴重危害養豬業的重要疫病之一，給養豬業造成巨大的經濟損失[3]。此外，豬群中的JEV經蚊媒傳播可導致人群及動物的感染，給公共衛生安全帶來極大的威脅。

JEV屬于黃病毒科(Flaviviridae)，黃病毒屬(Flavivirus)成員。病毒基因組為單股、正鏈RNA，全長約11 kb，裸露的病毒RNA具有感染性。含有一個開放閱讀框(ORF)，編碼1個全長為3 432個氨基酸的多聚蛋白前體，成熟切割加工后可形成3個結構蛋白(核衣殼蛋白C、膜蛋白PrM/M和囊膜糖蛋白E)和7個非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)及兩個多肽切割片段[4]。Chen W R和印度學者Uchil分別利用C-PrM、E基因核苷酸序列進行分型顯示，到目前為止，JEV在世界范圍內存在5個基因型[5- 6]。以往的基因分型顯示，同一地區只有一種基因型的分布[7]，而最近幾年許多地區出現新的基因型，同一地區的基因型分布越來越混雜。國內有許多學者在乙腦不同的流行區域分離毒株進行分子流行病學研究，以了解目前自然界JEV的流行分布、分子進化、毒力變異等情況。本研究對從貴州省發病豬睪丸組織中分離到的JEV GZ0409-31毒株的E基因進行序列測定，分析該毒株同其他JEV毒株的親緣關系，從分子水平上研究JE毒株的變異情況。充分了解該毒株的分子進化情況，對JEV的分子流行病學調查、病毒抗原性、病毒基因型、病毒變異及基因工程疫苗的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 毒株背景 2004年從貴州省發病豬的睪丸組織中分離到JEV GZ0409-31分離株，病毒在PK15細胞中傳代擴增后置于-80 ℃冰箱中儲存。

1.2 病毒RNA提取及RT-PCR鑒定 參照TRIZol Reagent試劑說明書抽提JEV GZ0409-31分離株的總RNA。使用M-MLV反轉錄酶及隨機引物將RNA轉錄為cDNA，反應條件為：42 ℃反轉錄1 h。以反轉獲得的cDNA為模板進行PCR擴增，擴增引物送上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

E1：5＇-CGGAATTCACATGTTTAATTGTCTGGGAAT-3＇；

E2：5＇-CGGGATCCATATC AGCATGCACATTGGT-3＇

PCR反應條件為：95 ℃預變性4 min；95 ℃ 變性30 s，59 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸1.5 min，共30個循環；72 ℃ 延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行鑒定。

1.3 基因克隆及序列測定 參照OMEGA公司的DNA凝膠回收試劑盒(E.Z.N.A?Gel Extraction Kit 50)將PCR產物純化回收，克隆入pMD18-T載體，選取陽性重組質粒送上海英駿生物技術有限公司進行序列測定。

1.4 GZ0409-31分離株E基因核苷酸及推導的氨基酸序列分析 使用DNAStar軟件將JEV GZ0409-31分離株的E基因核苷酸和推導的氨基酸序列與GenBank中不同地區、不同年代分離的各基因型JEV毒株相應序列進行比對，分析它們之間的相似性。

1.5 GZ0409-31分離株E基因進化關系分析 從GenBank中選擇JE流行的多個國家和地區的各基因型JEV毒株的E基因序列，另選1株墨累河谷腦炎病毒株(MVEV)作為外群，采用NJ(Neighbor Joining)法，以E基因核苷酸序列為基礎構建GZ0409-31分離株E基因進化樹。

2 結果

2.1 GZ0409-31分離株E基因RT-PCR擴增 從病毒液中提取GZ0409-31分離株RNA進行E基因的RT-PCR，擴增產物電泳鑒定結果見圖1。由圖1可見，E基因擴增出約1 500 bp大小的片段，與預期片段大小相符。

圖1 GZ0409-31分離株E基因RT- PCR擴增結果M：DNA Marker DL-5 000； 1：E基因片段； 2：空白對照

2.2 GZ0409-31分離株E基因序列測定與分析 將擴增出的E基因片段克隆至pMD18-T載體，進行菌落篩選培養及質粒PCR鑒定，后經上海英駿生物技術有限公司測序，獲得其序列數據。應用DNAStar軟件對GZ0409-31分離株E基因核苷酸和氨基酸序列與GenBank的JEV參考毒株序列進行相似性比較分析。結果表明，GZ0409-31分離株E基因與基因 Ⅲ 型參考毒株SA14、JE-84等相應序列的核苷酸相似性在96.2%～99.2%之間；與基因Ⅰ 型參考毒株SC04-27、HN04-11等相應序列的核苷酸相似性在87.9%～88.3%之間；與基因 Ⅱ 型參考毒株JKT5441、FU相應序列的核苷酸相似性分別為88.7%、88.3%；與基因 Ⅳ 型參考毒株JKT9092的核苷酸相似性為86.8%；與基因Ⅴ 型參考毒株Muar相應序列的核苷酸相似性為78.1%。其中，GZ0409-31分離株E基因序列與基因 Ⅲ 型的JE-84株相應序列的核苷酸相似性最高，為99.2%，與基因Ⅴ 型參考毒株Muar的相似性最低，為78.1%。在氨基酸水平上，GZ0409-31分離株E基因推導的氨基酸序列與各參考毒株相應序列的相似性均在90%以上，其中與強毒株SA14的氨基酸相似性高達99.8%，與減毒活疫苗株SA14-14-2株的氨基酸相似性為97.8%。

2.3 GZ0409-31分離株E基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列遺傳進化分析 選擇國內外已發表的JEV不同分離毒株基因型作為參考毒株，同時選l株墨累谷腦炎病毒(MVEV)作為外群，利用DNAStar和MEGA4.0分析軟件對GZ0409-31分離株E基因進行遺傳進化分析。結果顯示，所有毒株在基因進化上分為5大簇，GZ0409-31分離株與歸屬基因 Ⅲ型的SA14源病毒株(SA14、SA14-14-2)，國內JEV分離株Beijing-1、p3、Ha-3以及國外分離株VN50、Je-84等同處一個大分支，遺傳關系較近。根據同源性及進化樹上分支的可信度，我們可以判定GZ0409-31分離株屬于JEV基因 Ⅲ 型(圖2)。

圖2 GZ0409-31株E基因遺傳進化樹

3 討論

本研究通過對GZ0409-31分離株E基因核苷酸和推導的氨基酸序列與參考毒株序列進行對比分析，發現GZ0409-31分離株E基因與野毒株SA14相應序列存在28個核苷酸、1個氨基酸不一致，與弱毒疫苗株SA14-14-2相應序列存在37個核苷酸、11個氨基酸不一致。有研究表明，JEV強弱毒株間E蛋白氨基酸變化與該病毒毒力相關[8-11]，與減毒關系密切的有E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315和E439等幾個位點，其中尤其是E138和E176位點在JEV的減毒過程起了重要作用，這兩個位點氨基酸突變可能改變了E蛋自對細胞受體的吸附性，或者引起該病毒對其他細胞不可穿透，這兩種機理導致病毒毒力減弱[12-14]。Ni等在對JEV減毒機理進行研究時認為，E138位的谷氨酸(E)替代為賴氨酸(K)后毒力明顯的降低[15-16]。本研究結果表明，GZ0409-31分離株與SA14野毒株的E蛋白氨基酸序列幾乎一致，只存在一個氨基酸不一致，其毒力關鍵位點E138和E176也沒有發生改變，因此推測兩毒株E蛋白在結構、功能及生物學活性上也極為相似；而SA14-14-2弱毒株的E基因在毒力關鍵位點E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315和E439等都發生改變。由此可見，GZ0409-31分離株與疫苗株相比其毒力較強，親緣關系更接近SA14野毒株。

JEV遺傳進化分析主要以Chen等[5]建立的依據 prM 基因的240個核苷酸和 Paranjpe等[17]依據E基因全序列進行JEV 基因分型。由于prM 基因的240個核苷酸序列較短，分析結果存在一定程度的可變性，而E蛋白基因被認為具有良好的代表性，常用作JEV遺傳進化分析的主要方法[18]。Wang等[19]對中國1949-2005年間10個省、市的JEV分離株的研究顯示，中國以基因 Ⅲ 型為主，兼有基因Ⅰ型。其中基因Ⅰ型的毒株最早分離來自1977年的云南省，隨后河南、廣西、遼寧、上海、四川的分離株也存在基因Ⅰ型；基因 Ⅲ 型分離株多來自黑龍江、北京、陜西、貴州、福建；遼寧、云南、上海、四川為基因Ⅰ型和基因 Ⅲ 型共存。另外，相同省份在不同的年份流行株的基因型也有不一致，例如上海在2001、2003、2005年分離到的流行株均為基因Ⅰ型，而2004年主要為基因 Ⅲ 型。2006年河南省南陽市的流行株全部屬于基因Ⅰ型，而河南省2004年的流行株也均屬于基因Ⅰ型[20]。本研究選擇國內外已發表的JEV不同分離株為參考毒株，同時選l株墨累谷腦炎病毒(MVEV)作為外群，利用DNAStar和MEGA4.0分析軟件分別以GZ0409-31分離株E基因進行遺傳進化分析。結果表明，GZ0409-31分離株與SA14源病毒株(SA14、SA14-14-2等) 基因 Ⅲ型的、國內JEV分離株Beijing-1、p3、Ha-3以及國外分離株VN-50、01VN88等同處一個大分支，遺傳關系較近。綜上所述，GZ0409-31分離株E基因核苷酸及推導的氨基酸序列與JEV基因 Ⅲ型相應序列相似性最高，由此表明，GZ0409-31分離株屬于JEV基因 Ⅲ型。

[1] 梁劍，劉美真，胡培，等. 2009-2015年廣東省流行性乙型腦炎流行病學及臨床特征分析[J]. 現代預防醫學，2016(21): 3 865-3 868.

[2] Mansfield K L, Hernandez-Triana L M, Banyard A C,etal. Japanese encephalitis virus infection, diagnosis and control in domestic animals[J]. Vet Microbiol,2017, 201: 85-92.

[3] 徐微，張桂紅，喻正軍. 豬乙型腦炎疫苗研究新進展[J]. 豬業科學，2016(05): 98-99.

[4] Lu C Y, Hour M J, Wang C Y,etal. Single-Round Infectious Particle Antiviral Screening Assays for the Japanese Encephalitis Virus[J]. Viruses，2017, 9(4).

[5] Fan J M, Luo J, Chen L,etal. Genetic analysis of strains of Japanese Encephalitis Virus isolated from swine in central China[J]. Virus Genes，2010, 40(3): 357-361.

[6] Chen W R, Tesh R B, Rico-Hesse R. Genetic variation of Japanese encephalitis virus in nature[J]. J Gen Virol，1990, 71 (Pt 12): 2 915-2 922.

[7] Sarkar A, Taraphdar D, Mukhopadhyay B B,etal. Influence of socio-economic status and environmental factors on serologically diagnosed Japanese encephalitis cases in the state of West Bengal, India during 2005-2010[J]. Health, 2012, 4(1):6-12.

[8] Gulati B R, Singha H, Singh B K,etal. Isolation and genetic characterization of Japanese encephalitis virus from equines in India[J]. J Vet Sci，2012, 13(2): 111-118.

[9] 李云云，郭萬柱. 流行性乙型腦炎病毒E蛋白主要抗原表位的原核表達[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2014(01): 14-16.

[10] 楊會強，倪謙枝，劉杰，等. 乙型腦炎減毒活疫苗E蛋白基因及氨基酸序列穩定性分析[J]. 中國生物制品學雜志，2013(12): 1 701-1 704.

[11] 楊邦玲，王洪強，王凱，等. 乙型腦炎減毒活疫苗毒力穩定性分析[J]. 中國生物制品學雜志，2014(12): 1 512-1 516.

[12] 劉永樂，王艷君，呂英超. 豬乙型腦炎病的診治[J]. 中國動物保健，2017(04): 35.

[13] Heffelfinger J D, Li X, Batmunkh N,etal. Japanese Encephalitis Surveillance and Immunization - Asia and Western Pacific Regions, 2016[J]. Mmwr Morb Mortal Wkly Rep，2017, 66(22): 579-583.

[14] Gromowski G D, Firestone C Y, Whitehead S S. Genetic Determinants of Japanese Encephalitis Virus Vaccine Strain SA14-14-2 That Govern Attenuation of Virulence in Mice[J]. J Virol，2015, 89(12): 6 328-6 337.

[15] Liu X Y, Yu Y X, Jia L L,etal. Molecular biological characteristics of Japanese encephalitis virus M47strain with low neuroinvasiveness[J]. Chinese Journal of Biologicals，2014, 27 (9): 1 127-1 131.

[16] 唐波，張道華，張雪花，等. 一株豬源乙型腦炎病毒的分離及鑒定[J]. 浙江農業學報,2015(10): 1 698-1 703.

[17] Paranjpe S, Banerjee K. Phylogenetic analysis of the envelope gene of Japanese encephalitis virus[J]. Virus Res，1996, 42(1-2): 107-117.

[18] Chu H, Wu Z, Chen H,etal. Japanese Encephalitis Virus Infection Rate and Detection of Genotype I From Culex tritaeniorhynchus Collected From Jiangsu, China[J]. Vector Borne Zoonotic Dis,2017, 17(7): 503-509.

[19] Wang H Y, Takasaki T, Fu S H,etal. Molecular epidemiological analysis of Japanese encephalitis virus in China[J]. J Gen Virol,2007, 88(Pt 3): 885-894.

[20] Yuan L, Wu R, Liu H,etal. Tissue tropism and molecular characterization of a Japanese encephalitis virus strain isolated from pigs in southwest China[J]. Virus Res，2016, 215: 55-64.

GeneticEvolutionofEgeneofSwineJapaneseEncephalitisVirusGZ0409-31Strain

LIAO Jie-dan1,2， LIU Wei2,3， ZHU Meng-jiao2， ZHAO Ming-qiu2， CHEN Jin-ding2

(1.College of Life Science and Engineering，FoShan University, Foshan 528231, China;2.College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;3. Guangdong Winsun Bio-pharmaceutical co., Itd，Guangzhou 511356, China)

In this study, theEgene ofJapaneseencephalitisvirusGZ0409-31 strain isolated from testicular tissue of Guizhou Province was cloned and sequenced by RT-PCR. The molecular genetic evolution ofEgene nucleotide sequence and deduced amino acid sequence was analyzed by bioinformatics software. The results showed that theJapaneseencephalitisvirusGZ0409-31 strain was the same genotype as the genotype Ⅲ of the Japanese encephalitis virus, and the genetic evolution was similar.

Swine;Encephalitisvirus;Egene; Genetic evolution analysis

CHEN Jin-ding

S855.3

A

0529-6005(2017)09-0003-04

2017-07-06

國家重點研發計劃項目(2017YFD0500600,2017YFD050114);廣東省科技計劃項目(2015B020230009，2015A050502044)

廖潔丹(1979-)，女，講師，博士，研究方向為獸醫微生物與免疫學，E-mail：liaojiedan@163.com

劉薇(1988-)，女，碩士,研究方向為獸醫微生物與免疫學，E-mail:liunei_10000@163.com

注：劉薇與廖潔丹對本文具有同等貢獻

陳金頂，E-mail：jdchen@sacu.edu.cn