海水養殖廢水沉積物中硝化細菌的分離及修復無機氮污染的研究*

劉彥彥 許振成# 曾 東 陳峻峰 胡艷芳 張偉麗 胡立瓊

(1.環境保護部華南環境科學研究所，廣東 廣州 510655；2.華南理工大學環境與能源學院，廣東 廣州 510006)

海水養殖廢水沉積物中硝化細菌的分離及修復無機氮污染的研究*

劉彥彥1許振成1#曾 東1陳峻峰2胡艷芳1張偉麗1胡立瓊1

(1.環境保護部華南環境科學研究所，廣東 廣州 510655；2.華南理工大學環境與能源學院，廣東 廣州 510006)

針對海水養殖廢水中的無機氮污染，從某石斑魚養殖池底沉積物中篩選出5株硝化細菌(5～9號)，并利用該菌進行去除養殖廢水中無機氮的實驗。結果表明，5株硝化細菌對養殖廢水中氨氮、總氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮均具有去除作用，對硝酸鹽氮的去除存在相對延滯。其中，7號菌株去除效果最好，6h時對氨氮、總氮、亞硝酸鹽氮的去除率分別為48%、17%和13%；36h對硝酸鹽氮的去除率達18%。

養殖廢水 硝化細菌 無機氮 生態修復

Abstract: For inorganic nitrogen pollution of mariculture wastewater，five nitrifying strains (number 5-9) were screened out from a grouper aquaculture bottom sediments. The five nitrifying strains had certain removal effect of ammonia，total nitrogen, nitrate nitrogen and nitrite nitrogen to the grouper aquaculture wastewater, however, there was a relative delay for the removal of nitrate nitrogen. The screened number 7 strains had a better removal efficiency of ammonia nitrogen, total nitrogen and nitrite nitrogen in short time，the removal efficiency was 48%，17% and 13% at 6 h;and the number 7 strains achieved 18% of the removal efficiency of nitrate nitrogen at 36 h.

Keywords: mariculture wastewater; nitrifying strains; inorganic nitrogen; biological remediation

近幾十年來，我國的海水養殖產量呈逐年遞增態勢，水產養殖已成為我國農業的支柱性產業之一[1-2]。傳統的水產養殖業已由小范圍、分散經營向規模化、集約化方向發展[3-5]。污染的問題也隨之產生，近海水域環境嚴重惡化，從而導致了近岸海域生態系統失衡，嚴重影響了水產養殖生態安全，制約了海水養殖業的可持續發展[6]。海水養殖廢水污染主要來源于殘剩飼料、養殖體排泄物、各類化學藥品等，主要污染元素為氮、磷和有機物[7]。海水養殖廢水具有兩個明顯的特點：潛在污染物含量低、水量大和廢水分布分散。水產養殖過程中，水體的氨、硝酸鹽、亞硝酸鹽等營養元素含量過高所造成的富營養化情況頻繁出現[8-12]。除了會改變水質與生物平衡外，氨氮和亞硝酸鹽氮等毒性較高會對水生動物造成嚴重影響[13-16]。目前，海水養殖修復技術主要包括3類：物理、化學和生物修復。常見物理修復有底泥疏浚、換水、曝氣、篩網、潑撒沸石灰等，但這類方法常需要較高的投資和運轉費用，并且處理效果不徹底[17]；化學修復主要是運用水質改良劑、水質消毒劑和殺藻劑等改善養殖環境，但化學修復劑易產生有害的次生產物，使得水生態系統健康狀況惡化，水產品品質退化[18]；生物修復是指生物尤其是微生物催化降解環境污染物，減少或消除環境污染的自發過程[19-22]。微生物法是一種較理想的方法，由微生物引起的硝化-反硝化作用是水中氮素釋放的重要機制之一[23-25]。

目前，已知的硝化細菌大多是從淡水環境中分離得來，能用于海水養殖中水處理的報道較少[26-29]。硝化細菌是一類具有硝化作用的化能自養細菌，是生物硝化中起主要作用的微生物，污水中硝化細菌的含量與硝化速度成正比關系[30-31]。因此，硝化細菌具有良好的凈化水質的效果，可用于海水養殖生物修復過程[32]。本研究從海水養殖廢水沉積物中進行硝化細菌的篩選和分離，然后利用該菌種進行去除養殖廢水無機氮的實驗，從而為海水養殖廢水無機氮污染的生物修復提供菌種儲備和理論支持。

表1 養殖廢水主要水質指標

1 材料與方法

1.1 菌株和廢水來源

菌株分離樣品采自海南省馮家灣區域某石斑魚養殖池底沉積物，該養殖場地理坐標為110°41′43.6″E，19°24′31.0″N。將菌株分離樣品裝入無菌離心管中，放入冰盒中帶回實驗室4 ℃保存備用。實驗用養殖廢水取自該養殖池，主要水質指標見表1。

1.2 培養基

微量元素溶液：ZnSO42.2 g，CaCl2·2H2O 5.5 g，FeSO4·7H2O 5.0 g，CuSO4·5H2O 1.57 g，CoCl2·6H2O 1.61 g，MnCl2·4H2O 5.0 g，Na2MoO4·4H2O 1.1 g，乙二胺四乙酸二鈉63.7 g，去離子水1 000 mL組成。

亞硝酸細菌液體培養基：每升由NH4Cl 0.4 g、K2HPO4·3H2O 8.0 g、KH2PO41.5 g、CH3COONa 4.4 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、微量元素溶液1 mL組成，pH為7.0～7.3。于121 ℃下滅菌20 min備用。

硝酸細菌液體培養基：每升由NaNO21.0 g、NaCO31.0 g、CaCO31.0 g、K2HPO4·3H2O 8.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、微量元素溶液1 mL組成，pH為7.0～7.3。于121 ℃下滅菌20 min備用。

固體培養基：相應液體培養基中加入3%(質量分數)的瓊脂粉。

固體斜面培養基：將相應的液體培養基裝入20 mL試管中，每支試管裝入1/3(體積分數)，再加入3%的瓊脂粉。

1.3 硝化細菌的富集培養

稱取兩份40 g沉積物樣品，在無菌操作臺上分別接種于事先已滅菌、內裝玻璃珠的200 mL亞硝酸細菌、硝酸細菌液體培養基的三角瓶中，置于水浴恒溫振蕩器內以26 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養2 d。于無菌操作臺上分別將培養液接種至新的亞硝酸細菌、硝酸細菌液體培養基，接種量為5%(體積分數)。重復此操作3次，共培養8 d，待用。

1.4 硝化細菌的分離純化

取上述已富集的培養液分別劃線至亞硝酸細菌、硝酸細菌固體培養基。用接種環挑取培養液在事先制好的平板上劃線至劃滿整個平皿，再于30 ℃恒溫生化培養箱中培養，3～4 d后挑取單菌落劃線至新的平板，重復操作5次，最后分離出長勢較好的單菌落。

1.5 硝化細菌的菌種保存

用接種環分別將上述長勢較好的10株亞硝酸細菌和硝酸細菌單菌落劃線至亞硝酸細菌、硝酸細菌固體斜面培養基，于30 ℃下恒溫生化培養箱中培養3 d后，放置4 ℃冰箱保存。

1.6 硝化細菌的鑒定

1.6.1 生理指標鑒定

亞硝酸細菌鑒定：取10株亞硝酸細菌單菌落接種于亞硝酸細菌液體培養基，另取一份亞硝酸細菌液體培養基接種無菌水作為對照。于26 ℃恒溫振蕩器中培養48 h。取培養液及對照液于白瓷比色板上，加格里斯試劑甲液和乙液各一滴，若有亞硝酸存在則呈紅色。實驗結果表明，5～9號菌株培養液均呈現紅色，而其他菌株及對照并沒有顯色。因此，5～9號菌株均有硝化活性，即為亞硝酸細菌。

硝酸細菌鑒定：取10株硝酸細菌單菌落接種于硝酸細菌液體培養基，另取一份硝酸細菌液體培養基接種無菌水作為對照。于26 ℃恒溫振蕩器中培養48 h。取培養液10 mL于試管中，加入醋酸5～8滴使之酸化，再加入數粒對氨基苯磺酸，當停止放氣時，加入一粒對氨基苯磺酸，此過程中NO-轉化為氮氣逸出。分別取去除NO-后的培養液及對照液于白瓷比色板上，逐滴加入加格里斯試劑，如不呈現紅色，證明亞硝酸已完全消失。再加二苯胺試劑2～4滴，如呈現藍色說明有硝化細菌的存在。實驗結果表明，均未出現藍色，證明不存在將亞硝酸氧化成硝酸的菌株，即不存在硝酸細菌。

1.6.2 分子生物學鑒定

對所篩選細菌做16S rDNA做norB的基因擴增，根據美國國立生物技術信息中心(NCBI)設計：上游引物F(5’-CGGAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC-3’)和下游引物R(5’-CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC-3’)。聚合酶鏈式反應(PCR)擴增體系：DNA聚合酶(Easy Taq DNA Polymeerase)1 μL(5 U)，10倍的內切酶緩沖液(Easy Taq Buffer)5 μL(200 mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl，200 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH4)2SO4，20 mmol/L MgSO4)，2.5 mmol/L三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTPs)4 μL，引物為1 μL(20 μmol/L)，模板DNA為1 μL，其余用雙蒸水補足至50 μL。PCR程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR反應后以1%(體積分數)的瓊脂糖凝膠電泳檢測[33-34]。

1.7 硝化細菌去除無機氮性能測試

養殖廢水使用前先經121 ℃下滅菌20 min。將篩出的5株硝化細菌(5～9號)菌株于無菌臺分別接種于500 mL養殖廢水中。使用接種環向每瓶培養液接入3環菌株，另取一瓶養殖廢水接種無菌水作為對照。將培養液置于120 r/min、30 ℃的恒溫振蕩器中。每次取樣測定樣品DO、氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮，測定方法見文獻[35]，取樣時間為接種后6、12、24、36、48 h。養殖廢水經菌種處理后排入集中處理工程。

2 結果與討論

2.1 硝化菌株的分子生物學鑒定

將PCR產物送至深圳華大基因科技有限公司做測序，所測的序列長度在1 000 bp左右。將所得序列使用GenBank的BLAST程序進行比對，獲得各序列的同源性信息，然后運用分子進化遺傳分析軟件MEGA5.0中的Kimura2-parameter模型計算各序列間的距離和序列相似性等，采用鄰接法構建系統發育樹，結果見圖1。

由圖1可知，5、6號菌與硝化桿菌(Nitrobacter)(NC_007406.1)具有最大同源相似性；7號菌與硝化菌(Nitrobactersp.)(NZ_CH672423.1、NZ_CH672418.1)具有最大同源相似性；8、9號菌與NitrobacterNC_007964.1具有最大的同源相似性。因此，結合1.6節，所篩選的5～9號細菌均為硝化細菌。

2.2 硝化細菌去除無機氮性能測試結果

2.2.1 氨 氮

氨氮過高對水產養殖有毒害，非離子氨進入水生生物體內后，對酶水解反應和膜穩定性產生明顯影響，影響水生生物的生理生化指標與生長狀況，進而影響水產養殖產量，因此要降低氨氮濃度。由圖2可知，5號菌隨著時間的延長對氨氮的去除率呈現先增大后減小的趨勢，12 h時對氨氮達到最大去除率(42%)，之后對氨氮的去除率持續下降；6號菌在前36 h內對氨氮的去除率呈現緩慢增長趨勢，36 h時達到最大去除率(27%)，36～48 h對氨氮去除率明顯下降；7號菌在6 h時對氨氮去除率達到最大(48%)，之后呈緩慢降低的趨勢，但其對氨氮均保持較高的去除率；8號菌隨著時間的延長對氨氮去除率穩定在12%左右，表明8號菌對氨氮的去除效果具有持續穩定性；9號菌對氨氮去除率呈先降低后升高的趨勢，6 h時去除率最大(36%)，24 h時去除率最小(18%)，36～48 h又恢復到較高的去除率。總體上，7、9號菌對氨氮去除效果具有穩定高效的去除效果，且7號菌對氨氮的去除效果優于9號菌；5、6號菌對氨氮去除作用時間較長，不利于氨氮的快速去除；8號菌對氨氮去除效果持續穩定，但其去除率較低，不利于氨氮的高效去除。不同菌株對氨氮去除效果存在較大差異可能與其本身對氨氮的耐受性、自身新陳代謝營養需求及其他環境因素(如DO、pH的變化)的差異而造成。劉少敏等[36]以聚乙烯醇-海藻酸鈉作為包埋載體固定硝化細菌，制備固定小球，對生活污水中的氨氮去除效果進行研究，結果表明，在最佳條件狀態下對生活污水中氨氮去除率超過90%。本實驗采用的原位添加細菌處理養殖廢水的方法達到48%的去除效果，表明所篩選硝化細菌具有良好的氨氮去除效果。

圖1 根據序列和BLAST建立的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic trees of bacterial based on the results of BLAST of sequences

圖2 不同硝化菌株處理下廢水氨氮變化情況Fig.2 The changes of ammonia content of the waste water under the different nitrifying strains

2.2.2 總 氮

水產養殖中總氮升高，會影響水體C/N，造成水質惡化，并影響水產養殖產量。由圖3可知，對總氮的整體去除效果為7號菌>9號菌>8號菌>5號菌>6號菌。7號菌株在6 h對總氮達到一個較大的去除率(17%)，且隨著時間的推移，7號菌對總氮去除效果持續高效穩定在17%左右。由此可知，所篩選出的5株硝化細菌對總氮的去除均具有一定的作用，而總氮的去除與反硝化作用有關，水產養殖一步步消耗水體中的DO，使得水體呈現缺氧狀態，通過反硝化作用，將硝酸鹽氮轉化為氮氣從水體中逸出，總氮得以在反硝化作用下去除。蘇俊峰等[37]從生物陶粒反應器中篩選出6株異養硝化細菌，將異養硝化細菌擴大培養后，建立序批式活性污泥法(SBR)反應器并進行了總氮去除的研究，結果表明，其對總氮的最大去除率為47.27%。本研究中總氮去除率低于該值，這與SBR間歇運行方式有關，故其總氮去除率相對較高。

圖3 不同硝化菌株處理下廢水總氮變化情況Fig.3 The changes of total nitrogen of the waste water under the different nitrifying strains

2.2.3 硝酸鹽氮

由圖4可知，6、12 h，硝酸鹽氮呈現增加趨勢。這與硝化細菌將氨氮轉化為硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮有關，相應的氨氮含量降低。24～48 h，隨著大部分的氨氮已初步轉化，硝化細菌開始其對硝酸鹽氮的降解產生作用，不同菌株對硝酸鹽氮的去除效果總體為7號菌>8號菌>5號菌>6號菌>9號菌，36 h時7號菌株對硝酸鹽氮的去除率達到最大(18%)。由此可知，所篩選出的硝化菌株對硝酸鹽氮均具有一定的去除效果，且其作用時間均存在相對延滯。張峰峰等[38]研究表明，硝酸鹽氮的去除主要是反硝化細菌起作用。本實驗中大部分的氨氮初步轉化完全后，硝化細菌開始以硝酸鹽氮為氮源，硝酸鹽氮含量減少。

圖4 不同硝化菌株處理下廢水硝酸鹽氮變化情況Fig.4 The changes of nitrate nitrogen of the waste water under the different nitrifying strains

2.2.4 亞硝酸鹽氮

水體中亞硝酸鹽濃度過高，易造成水生生物亞硝酸鹽中毒，也是對水產養殖危害較大的無機氮污染[39]。由圖5可知，不同硝化菌株對亞硝酸鹽氮的去除效果總體為7號菌>9號菌>5號菌>6號菌>8號菌；7號菌在取樣的前3個時間段均對亞硝酸鹽氮的去除保持一個較高穩定的去除率，6 h時達到最大去除率(13%)。隨著時間推移，氨氮被硝化細菌氧化成硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮，使得硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的含量呈現增加狀態，從而使得亞硝酸鹽氮在48 h時去除相對不明顯。部分的硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮在缺氧狀態下隨著反硝化作用生成氮氣得以去除，亞硝酸鹽氮維持在一個相對平衡的緩慢減少的狀態，這對于水產養殖是十分有利的。何騰霞等[40]研究表明，亞硝酸鹽氮的去除與反硝化細菌有關，其篩選出的耐冷反硝化細菌對亞硝酸鹽具有高效的去除效果。

圖5 不同硝化菌株處理下廢水硝酸鹽氮變化情況Fig.5 The changes of nitrite nitrogen of the waste water under the different nitrifying strains

3 結 論

5株硝化細菌對養殖廢水中氨氮、總氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮均具有去除作用，對硝酸鹽氮的去除存在相對延滯。其中，7號菌株去除效果最好，6 h時對氨氮、總氮、亞硝酸鹽氮的去除率分別為48%、17%和13%；36 h對硝酸鹽氮的去除率達18%。

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Researchonscreeningofnitrifyingbacteriafrommariculturewastewatersedimentsandbioremediationinorganicnitrogen

LIUYanyan1，XUZhencheng1，ZENGDong1，CHENJunfeng2，HUYanfang1，ZHANGWeili1，HULiqiong1.

(1.SouthChinaInstituteofEnvironmentalScience，MEP，GuangzhouGuangdong510655；2.SchoolofEnvironmentandEnergy，SouthChinaUniversityofTechnology，GuangzhouGuangdong510006)

2016-05-03)

劉彥彥，女，1989年生，碩士，主要從事水污染控制與給水凈化方面的工作。#

。

*國家水體污染控制與治理科技重大專項(No.2012ZX07206)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.08.002