滇重樓連續(xù)灌胃對腸黏膜功能障礙的抗炎保護作用

熊偉+陳思如+修光輝+凌斌+孫潔+劉萍

摘要：目的 觀察不同劑量滇重樓連續(xù)灌胃對腸黏膜功能障礙的影響，并探討其與全身炎癥反應的相關性。方法 構建大鼠腸黏膜功能障礙模型（LPS 15mg/kg），給予不同劑量滇重樓（20、40、80mg/kg）連續(xù)灌胃，于24Hr統(tǒng)計動物存活率及小腸推進率，取動脈全血，檢測動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）、肌酸激酶（CK）、凝血酶原時間（PT）、谷草轉氨酶（AST）和尿素氮（BUN）的含量，于1、7days取小腸行病理組織學檢查，于1、3、7、14days取材動脈全血及小腸，ELISA法檢測血漿中二胺氧化酶（DAO）及小腸中HMGB1的含量。結果 模型組大鼠與對照組比較全血中CK、PT、AST、BUN含量升高，PaCO2含量下降，存活率及小腸推進率顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；不同濃度滇重樓治療組與模型組比較全血中CK、PT含量下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<005），PaCO2含量升高，存活率及小腸推進率升高，有統(tǒng)計學意義（P<005）；但治療組與模型組比較AST及高劑量組BUN差異無統(tǒng)計學意義（P>005）。1、3、7d時模型組血漿中DAO和HMGB1含量高于對照組，而1、3、7d時滇重樓治療組低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<005），14d時相差異無統(tǒng)計學意義（P>005）。結論 滇重樓連續(xù)灌胃可能通過下調晚期炎癥因子HMGB1表達，抑制全身炎癥反應，從而改善腸黏膜屏障功能，發(fā)揮抗炎保護作用。

關鍵詞：滇重樓；腸黏膜功能障礙；脂多糖；高遷移率族蛋白B1

中圖分類號：R2855 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2017）10-0068-04

Anti-inflammatory and Protective Effects of Continuous Intestine Administration

of Paris Polyphylla var Yunnanensison on Intestinal Mucosal Dysfunction

XIONG Wei， CHEN Si-ru， XIU Guang-hui， LING Bin， SUN Jie， LIU Ping

（Department of Severe Cases， the Fourth Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650021， China）

【Abstract】Objective： To observe the effect of different doses of Paris polyphylla var yunnanensison on intestinal mucosal dysfunction and to explore its correlation with systemic inflammatory response Methods： The rat model of intestinal mucosal dysfunction （LPS 15mg/kg） was established and the rats were continuously administrated with different doses （20， 40， 80mg/kg） of Paris polyphylla The survival rate and the small intestine propulsion rate were measured at 24 hours The rats were sacrificed to take their arterial whole blood to determine the contents of PaCO2， creatine kinase （CK）， prothrombin time （PT）， aspartate aminotransferase （AST） and urea nitrogen （BUN） The small intestine was examined by histopathology at the 1st and 7th day The arterial whole blood and small intestine were taken to determine diamines oxidase （DAO） and HMGB1 in the small intestine by ELISA at the 1st， 3rd， 7th and 14th day Results： Compared with that of the control group， the level of CK， PT， AST and BUN in the whole blood of the model group increased， but the content of PaCO2 decreased The survival rate and the small intestine propulsion rate significantly decreased （P<005） and the difference was statistical significance （P<005） Compared with that of the model group， the content of CK and PT in the whole blood of the different doses groups decreased and the difference was statistical significance （P<005）， but PaCO2 increased and the survival rate and the small intestine propulsion rate increased and the difference was statistical significance （P<005） But there was no significant difference between the treatment group and the model group in AST and high dose group （P>005） The levels of DAO and HMGB1 in the plasma of the model group were higher than those of the control group at the 1st， 3rd and 7th day of modeling and the difference was statistically significant （P<005）， but in the 14th day of modeling， the difference was not statistically significant （P>005） Conclusion： Continuous intestine administration of Paris Polyphylla var Yunnanensison may inhibit systemic inflammatory response by down-regulating the expression of late inflammatory cytokines HMGB1， thereby improve intestinal mucosal barrier function and exert anti-inflammatory and protective effectendprint

【Key words】Paris polyphylla var；Yunnanensison；intestinal mucosal dysfunction；lipopolysaccharide；HMGB1

腸黏膜功能障礙是膿毒癥患者常見并發(fā)癥之一，也是膿毒癥發(fā)病的始動環(huán)節(jié)，其機制包括腸黏膜細胞凋亡、腸通透性增加、胃腸動力失調、菌群移位、炎癥因子級聯(lián)釋放等，可使腸黏膜屏障（機械、免疫、生物、化學屏障）嚴重受損，從而加速全身炎癥反應綜合征（SIRS）向多器官功能障礙綜合征（MODS）發(fā)展[1-3]。腸黏膜功能障礙常表現(xiàn)為不同程度的食欲不振、便秘、腹瀉、腹脹、腹痛等，嚴重者甚至出現(xiàn)便血、腸梗阻、腹膜炎等。研究表明，膿毒癥患者的疾病嚴重程度與晚期炎癥因子高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）呈相關性[4]，因其廣泛存在于真核細胞內，病理狀態(tài)下可誘導其他炎癥因子釋放或靶細胞損傷，在膿毒性腸黏膜功能障礙的進展中具有樞紐作用。

黃彥峰等[5]報道重樓水提液可調節(jié)小腸運動從而治療腸道功能紊亂，其機理可能與M膽堿能受體、腎上腺素能系統(tǒng)有關。重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 可誘導小鼠淋巴細胞增殖效應，促進小鼠粒/巨噬細胞克隆形成細胞（GM-CFC）活化，增強細胞吞噬能力，直接參與抗炎反應[6]；此外，重樓還可刺激下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）分泌糖皮質激素間接參與抗炎反應[7]。在此基礎上，擬通過脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導的腸黏膜功能障礙模型，觀察不同劑量滇重樓連續(xù)灌胃對腸黏膜功能障礙的影響，并探討其與全身炎癥反應的相關性。

1 材料與方法

11 材料 滇重樓由昆明醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院藥劑科提供。清潔級健康成年SD大鼠雌性150只，體重（220±10）g，由解放軍昆明總醫(yī)院科研實驗中心提供（實驗動物質量合格證號：SYXK（滇）2015-2016）。活性炭末購于天津登科公司，羥甲基纖維素鈉購于上海申光公司。脂多糖購于美國Sigma公司；血漿二胺氧化酶（DAO）和晚期炎癥因子HMGB1 ELISA試劑盒購于武漢華美公司。

12 方法

121 動物分組及處理 清潔級健康雌性SD大鼠150只，自由飲食，隨機編號為5組，30只/組，分對照組、模型組、低劑量組、中等劑量組、高劑量組。各組大鼠禁食6h后，低、中、高劑量治療組分別予以20、40、80mg/kg滇重樓連續(xù)灌胃，對照組及模型組給予相同劑量生理鹽水灌胃；除對照組外，其余組經腹腔注射LPS 15mg/kg，對照組給予相同劑量生理鹽水腹腔注射；觀察大鼠外觀、習性及各項生理反應變化，正常飲食，精心護理。

122 動物存活率及小腸推進率的影響 于造模后24hr后，統(tǒng)計各組動物存活情況。禁食6h后，滇重樓治療組分別予以20、40、80mg/kg滇重樓連續(xù)灌胃，對照組及模型組給予相同劑量生理鹽水，給藥后30min，各組動物予以5%炭末懸液（活性炭末+05%羥甲基纖維素鈉）25ml/100g灌胃，20min后處死大鼠，結扎胃幽門部及回盲部，取小腸直線平鋪下測量，以幽門至回盲部為小腸總長度，以幽門至炭末推進前段為炭末推進距離，炭末推進率（%）=炭末推進距離/小腸總長度×100%。

123 實驗室指標檢測 于造模治療24hr后，4%水合氯醛1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，經腹主動脈取動脈血進行實驗室檢測，分別檢測各組動物血二氧化碳分壓（PaCO2）、肌酸激酶（CK）、凝血酶原時間（PT）、谷草轉氨酶（AST）和尿素氮（BUN）觀察模型成立及臟器功能變化情況。

124 小腸病理組織學檢測 于1、7days，分別取小腸組織用10%多聚甲醛溶液固定3～24h，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、常規(guī)切片和蘇木素-伊紅染色后，封片鏡檢觀察小腸組織損害程度。

125 ELISA法檢測DAO和HMGB1水平 于1、3、7、14days，分別取血漿制成檢測標本，按每孔100ul分別加標準品或待測樣本，37℃溫育，依次加生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液、底物溶液、終止溶液，終止反應后酶標儀測量各孔OD值，對照標準品進行統(tǒng)計分析。

13 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 200統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。全部數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差（x±s）表示，P<005有統(tǒng)計學意義；P>005無統(tǒng)計學意義。各實驗組的組間及組內均采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）對資料進行統(tǒng)計處理。率的比較用完全隨機設計資料χ2檢驗，P<005提示兩個率差異有統(tǒng)計學意義，P>005提示兩個率之間差異無統(tǒng)計學意義。

2 結果

21 動物存活率及小腸推進率的影響 模型組大鼠與對照組比較動物存活率及小腸推進率下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較動物存活率及小腸推進率上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<005），見表1。

22 生化指標檢測結果 模型組大鼠與對照組比較全血中CK、PT、AST、BUN含量升高，PaCO2含量下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較全血中CK、PT含量下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<005），PaCO2含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；但治療組與模型組比較AST及高劑量組BUN，差異無統(tǒng)計學意義（P>005），見表2。

22 小腸病理組織學檢測 對照組可見黏膜組織結構正常，腺體完整，無水腫、出血、白細胞浸潤。模型組1d時可見黏膜明顯水腫，腺體部分不完整，黏膜下及肌層內白細胞浸潤增多，7d時水腫及白細胞浸潤較前明顯減輕。不同濃度滇重樓治療組，1d時各組呈現(xiàn)出不同程度的黏膜水腫及白細胞浸潤，與模型組1d時組織結構接近，但中等劑量組和高劑量組較輕；7d時各組與對照組組織結構接近，僅輕度水腫，少量白細胞浸潤。見圖1。endprint

23 滇重樓對大鼠腸黏膜功能保護作用 1d、3d、7d時模型組與對照組比較血漿中DAO含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；1d、3d、7d時滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較血漿中DAO含量下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。14d時各組之間DAO無明顯差別，差異無統(tǒng)計學意義（P>005）。見表3，圖2。

24 滇重樓對大鼠小腸HMGB1的表達影響 1d、3d、7d時模型組與對照組比較小腸中HMGB1蛋白含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；1d、3d、7d時滇重樓治療組（低、中、高）與模型組比較小腸中HMGB1蛋白含量下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。14d時各組之間HMGB1無明顯差別，無統(tǒng)計學意義（P>005）。見表4，圖3。

3 討論

《滇南本草》記載重樓“為外科之至藥，主治一切無名腫毒，攻各種瘡毒癰疽，發(fā)背痘疔等癥最良”。姚勤等[8]采用耳腫法及毛細管通透性法觀察不同劑量重樓醇提物的抗炎作用，結果發(fā)現(xiàn)大、中劑量的重樓醇提物對二甲苯所致的耳廓腫脹及醋酸所致的毛細血管滲漏有明顯的抑制作用。滇重樓的抗炎特性在體內外實驗均得到證實，因云南獨有的氣候孕育了功效奇特的地道藥材，具有廣泛的市場開發(fā)和臨床推廣價值，結合前期實驗研究，滇重樓預處理可明顯改善膿毒癥大鼠轉歸及預后。但是，在腸黏膜功能障礙中滇重樓是否可通過抑制晚期炎癥因子HMGB1發(fā)揮抗炎保護作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組與對照組相比大鼠血中CK、PT、AST、BUN含量升高，PaCO2和小腸推進率下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<005），表明膿毒癥進展過程中包括心、肝、腎、腸、凝血等系統(tǒng)都受到不同程度的影響，表現(xiàn)出多器官功能障礙，且模型組大鼠死亡率60%，符合膿毒癥模型成功建立指標。經滇重樓連續(xù)灌胃后，1d時治療組小腸推進率高于模型組，但低于對照組；1、3、7d時模型組血漿中DAO和HMGB1含量高于對照組，而1、3、7d時滇重樓治療組低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<005），14d時相差異無統(tǒng)計學意義（P>005）。表明滇重樓能夠促進小腸推進，降低黏膜通透性，抑制炎癥因子釋放，從而穩(wěn)定腸道屏障功能，調整腸道蠕動，減少細菌移位及內毒素轉移，減緩膿毒癥進程，從而發(fā)揮腸道保護作用，在治療晚期炎癥反應得以控制，腸黏膜功能逐漸恢復，趨于正常。但治療組AST和BUN（高劑量組）與模型組差異無統(tǒng)計學意義（P>005），可能與滇重樓的肝腎毒性有關，在臨床運用中應注意劑量及療程的把握。據(jù)報道[9-12]，滇重樓等中藥可能刺激分泌營養(yǎng)因子、抗炎因子、神經介質等神經-體液途徑發(fā)揮抗炎保護作用，減輕腸黏膜功能障礙患者腹脹、腹瀉、腹痛等癥狀，從而改善轉歸及預后，降低住院費用、縮短住院周期、提升住院質量。

病理條件下，晚期炎癥因子HMGBl與各種炎癥因子一起參與炎癥反應，如細胞損傷、壞死可激活免疫細胞分泌HMGB1，使免疫細胞向損傷部位募集，同時通過其特異性受體（如RAGE、TLR2、TLR4、NF-κB）誘導其他炎癥因子釋放或靶細胞損傷，形成瀑布樣級聯(lián)損害[13-15]。在本實驗中，模型組小腸中HMGB1蛋白表達水平高于對照組，而滇重樓治療組低于模型組（P<005），說明滇重樓可能對晚期炎癥因子HMGB1有下調作用。綜上所述，滇重樓預處理可能通過下調晚期炎癥因子HMGB1表達，而改善小腸黏膜屏障通透性，發(fā)揮抗炎保護作用。

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