探討蛋白酶體功能障礙對散發性帕金森病發病機制的影響

黃優

572000 海南省第三人民醫院神經內科

探討蛋白酶體功能障礙對散發性帕金森病發病機制的影響

黃優

目的探討蛋白酶體功能障礙對散發性帕金森病的發病機制。方法收集本院2013年7月～2015年7月病例，將存在蛋白酶體功能障礙的帕金森病患者50例作為觀察組，未存在蛋白酶體功能障礙的帕金森病患者50例作為對照組，觀察2組患者的行為學改變情況，通過RT-PCR、Western blotting分子生物學方法檢測患者血液中α-突觸核蛋白(α-Syn)表達水平。結果觀察組患者血清的α-突觸核蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。結論蛋白酶體功能障礙可能導致散發性帕金森病患者血液中α-突觸核蛋白(α-Syn)水平升高，考慮該因素可能是散發性帕金森疾病的危險因素。

蛋白酶體功能障礙 α-突觸核蛋白(α-Syn) 散發性帕金森 發病機制

帕金森病是一種慢性進展性神經系統疾病，嚴重損害老年人的身體健康和影響老年人的日常生活，并給家庭和社會帶來經濟上沉重的負擔。在我國中老年人群中發病率已達0.2/100，且呈明顯上升趨勢[1-2]。臨床表現為靜止性震顫、動作遲緩、運動減少、肌強直和姿勢平衡障礙等4大主要特征，除了特征性的運動障礙等癥狀以外常伴有精神癥狀及認知功能障礙，主要表現為抑郁、多疑、思維遲鈍、癡呆、智能低下、幻覺等。臨床上以平衡障礙一步態異常為主要癥狀的帕金森病患者往往具有病程進展較快，出現抑郁、認知障礙、跌倒及殘疾的概率較高的特點。主要的病理特征是出現黑質的致密部位多巴胺能神經元的選擇性喪失，出現殘存路易小體，該病包括帕金森病癡呆和路易體癡呆，其中90%的患者呈現散在發生，即散發性的帕金森病[1]。目前該病主要的治療方法包括藥物及外科手術治療，但是都只是針對臨床表現，并不能阻止疾病的進程，該病的致殘率較高。該病的病理機制尚未完全明確，可能與遺傳及環境因素有關。有研究發現蛋白纖維化是散發性帕金森病患者導致神經元死亡的重要原因[2]。在疾病形成的過程中α-突觸核蛋白是與該病最為密切的相關蛋白，具有一定的神經毒性，同時受到脂肪酸的作用，在蛋白酶體功能障礙時會發生結構和構象變化，泛素-蛋白酶體系是細胞蛋白的重要系統，可以參與降解蛋白質和氧化蛋白質[3]。帕金森病患者中黑質致密部位氧化損傷的蛋白水平表達升高。多項研究都表明蛋白酶體可誘導神經細胞凋亡，同時促進胞質內泛素/α-共核蛋白免疫反應陽性包涵體形成[4]。這提示蛋白酶體障礙對神經系統發病起著重要作用，本研究通過探討蛋白酶體功能障礙對散發性帕金森病發病機制的影響，以期為其在散發性帕金森病發病機制提供依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細胞與儀器

逆轉錄試劑盒(MBI公司，美國)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidas，HRP)標記山羊抗兔IgG、HRP標記山羊抗小鼠IgG(碧云天生物技術有限公司)，Goat anti-rabbit Ig GHRP，Goat anti-mouse IgG-HRP，α-Syn rabbit polyclonal IgG和β-actin(C4)mouse monoclonal IgG1(購自美國Santa Cruz Biotechnology公司)，避光4 ℃保存。半干式轉移和電泳儀(購自美國BIO-RAD公司)。倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)、全能型高性能臺式冷凍離心機(Heaeus，BiofugeStratos德國)、深低溫冰箱(SANYO，AltraLow日本)、實時定量熒光PCR儀(Rotor-gene3000，澳大利亞)。

1.2 分組

收集本院2013年7月～2015年7月病例，將蛋白酶體功能障礙的帕金森病患者50例作為觀察組，其中女22例，男28例，所有的病例都是初治病例，H&Y分期不超過2期，其中1期18例，1.5期15例，2期17例，年齡20～70歲，平均年齡(61.25±10.23)歲。未存在蛋白酶體功能障礙的帕金森病患者50例作為對照組，其中男27例，女23例，年齡0～70歲，平均年齡(64.26±8.56)歲，H&Y分期不超過2期，其中1期18例，1.5期14例，2期18例。抽取患者的空腹血液，勻漿器充分勻漿，之后將其轉移至EP管中，以14 000 r/min離心30 min，取上清液移至新EP管保存，使用前經BCA法測定蛋白水平。

1.3 納入標準

①符合帕金森病的臨床診斷標準；②年齡20～70歲；③納入研究的患者均為接受過多巴胺受體激動劑及左旋多巴制劑的治療；④入組前頭顱影像學檢查排除帕金森綜合征及多系統萎縮等；⑤依從性強，愿意接受本臨床研究。

1.4 排除標準

①年齡<20歲或>70歲的患者；②存在其他軀體系統疾病，有嚴重其他系統疾病和惡性腫瘤的患者；③帕金森疊加綜合征、腦血管病、腦炎、一氧化碳中毒及藥物等影響的患者；④患者姿勢平衡障礙是由于其他疾病引起的；⑤存在嚴重的記憶障礙，研究對象的簡易智力狀態檢查MMSE<24分者；⑥不愿意接受本臨床研究，依從性差的患者。

1.5 RT-PCR(半定量逆轉錄聚合酶鏈反應)

抽取患者的空腹血液，每例血清100mg，提取總RNA。取2μg總RNA行逆轉錄cDNA，反應體系為20 μl；吸取逆轉錄產物2 μl，分別加入18sRNA、α-Syn的引物進行PCR反應；反應條件均為95 ℃預變性5 mins，94 ℃變性30 s，60 ℃30 s，72 ℃60 s，72 ℃7 mins，循環30次；PCR產物溴化乙錠1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統下進行觀察并拍攝電泳圖像；以18sRNA作為內參照，進行PCR產物的半定量分析，測量各電泳條帶之吸光度積分值(A值)。

1.6 Western blotting

取血清提取100 mg總蛋白；SDS-PAGE凝膠電泳，半干法轉膜，加α-Syn一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶1000)37 ℃孵育1 h；ECL光化學法顯色，用彩色圖像分析系統測定吸光度。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 α-Syn mRNA表達水平

觀察組患者的血清α-突觸核蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.05)(表2)。

表1 α-Syn mRNA表達水平的比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與治療前比較，△P<0.05

2.2 α-Syn蛋白表達水平

觀察組患者的血清α-突觸核蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.05)(表2)。

表2 α-Syn蛋白表達水平的比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與治療前比較，△P<0.05

3 討 論

帕金森病是臨床上的常見神經退行性疾病，與選擇性的中腦黑質致密部位的多巴胺能神經元丟失和退化相關，主要特征是中樞神經系統的變性[5]。最新的研究發現蛋白酶體受到抑制可以導致神經細胞的死亡，形成胞質的泛素-α-共核蛋白免疫反應包涵體使神經元退變，伴隨著黑質致密部位多巴胺的喪失，出現神經元的損傷。有研究發現蛋白酶體受損之后多巴胺能神經元會使蛋白酶抑制劑敏感性提高，個別神經細胞出現凋亡，通過選擇性損傷機制促使神經細胞的氧自由基的增多，需要蛋白酶體來清除這些受損的蛋白[6-8]。蛋白酶體抑制劑選擇性損害多巴胺能神經元可能與α-共核蛋白削弱了突觸囊泡對多巴胺的儲存，從而進一步增加了胞漿內多巴胺及氧自由基，進而導致細胞氧化受損有關[9-11]。

目前臨床尚未明確α-突觸核蛋白的正常功能，在多數散發性帕金森病患者中未發現其基因突變，提示α-Syn 可能在散發性帕金森病發病中起著重要作用。泛素蛋白酶體系統是α-Syn的主要降解途徑，如果發生障礙則會導致α-Syn 聚集，從而誘發散發性帕金森病的發病[12]。研究發現蛋白酶體成為影響細胞功能的重要藥物靶點，該靶點的抑制劑在臨床研究中被廣泛應用，α-共核蛋白的生理功能尚不清楚，同時散發性帕金森病患者機體內的α-共核蛋白量增高[13-14]。通過多種翻譯后修飾形式，引起黑質多巴胺能神經元死亡，中腦黑質內多種細胞、生化及分子改變已被發現，散發性帕金森病患者蛋白酶體α亞單位丟失，蛋白酶體活化因子表達下降，水解功能減弱[15]。大量的研究表明在帕金森病發病機制中蛋白酶體功能下降起重要作用，參與了黑質的神經元內蛋白質聚集及神經元變性[16]。本研究結果顯示，觀察組α-突觸核蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。這提示蛋白酶體功能障礙可能導致患者血清中的α-突觸核蛋白(α-Syn)形成，考慮該因素可能是散發性帕金森病的危險因素。蛋白酶體功能不能得到恢復，影響氧化受損的蛋白質的降解，從而降低了蛋白酶體的清除能力，同時氧化受損的蛋白集聚增多，從而造成惡性循環，導致神經元死亡[17]。

綜上所述，蛋白酶體功能障礙可能導致α-Syn血液中的聚集釋放，也可能是發生散發性帕金森病的重要危險因素。蛋白酶體功能下降可引起多巴胺能神經元內α-共核蛋白聚集，從而導致細胞功能的紊亂，最終促進了多巴胺能神經元的凋亡。

[1] MiwaH,KuboT,Suzuki A,et al.Retrograde dopam inergic neuron degeneration following intrastriatal proteasome inhibition[J].Neurosci Lett,2014,380(1/2):93-98.

[2] W IW,Haass C.Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease[J].Biochim Biophys Acta,2010,1802(1):29-44.

[3] A NA.Mitochondrial diseases[J].Lancet,2016,2(379):16081.

[4] B LB.Neural and immune mechanisms in the pathogenesis ofParkinson's disease[J].Journal of Neuroimmune Pharmacology,2013,8(1):189-201.

[5] 陳生弟,樂衛東,陳先文,等.帕金森病[M].北京:人民衛生出版社,2006.

[6] 李興安,張應玖,常明,等.散發性帕金森病蛋白酶體功能障礙及其所致的路易(小)體形成[J].生物化學與生物物理進展,2008,35(5):502-511.

[7] H IH,Vyas S,Hunot S.Neuroinflammation in parkinson's disease[J].Parkinsonism Relat Disord,2012,18(Suppl):210-212.

[8] K AK,Jin H,Mehrotra S,et al.Novel cell death signaling pathways in neurotoxicity models of dopaminergic degeneration:relevance to oxidative stress and neuroinflammation in Parkinson's disease[J].Neurotoxicology,2010,31(5):555-561.

[9] Y VY.Neuroinflammation inflammatory brain drain[J].Nat Rev Immunol,2013,13(2):69.

[10] M IM,Tentler JJ,Smith PG,et al.Role of ubiquitin ligases and the proteasome in oncogenesis:novel targets for anticancer therapies[J].Journal of Clinical Oncology,2013,31(9):1231-1238.

[11] E RE,Avvakumov G,Tong J,et al.A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system[J].Science,2013,339(6119):590-595.

[12] C OC,Hatchwell L,Verrills N,et al.The E3 ubiquitin ligase midline 1 promotes allergen and rhinovirus-induced asthma by inhibiting protein phosphatase 2A activity[J].Nat Med,2013,19(2):232-237.

[13] Y OY.Molecular dissection of autophagy two ubiquitin-like systems[J].Nature Review,2001,2(3):211-216.

[14] Y AY,Zhao D,Khan SH,et al.Role of autophagy in prion protein-induced neurodegenerative diseases[J].Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai),2013,45(6):494-502.

[15] C HC,Ryter SW,Levine B.Autophagy in human health and disease[J].N Engl J Med,2013,368(7):651-662.

[16] R UR,Marino G,Kroemer G.Autophagy and aging[J].Cell,2011,146(5):682-695.

[17] O RO,Sheng HK,Tasset I,et al.Interplay of LRRK2 with chaperone-mediated autophagy[J].Nature Neuroscience,2013,16(4):394-406.

R742.5

A

1007-0478(2017)05-0455-03

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.05.019

(2016-09-21收稿)