sEHi對頸動脈狹窄患者內皮祖細胞增殖及PI3K/Akt信號通路的影響

嚴靜 陳俊 艾志兵 周崗 丁立 何國厚

442000 湖北省十堰市湖北醫藥學院附屬太和醫院神經內科

sEHi對頸動脈狹窄患者內皮祖細胞增殖及PI3K/Akt信號通路的影響

嚴靜 陳俊 艾志兵 周崗 丁立 何國厚

目的探討可溶性環氧化物水解酶抑制劑 (sEHi) AUDA 調控頸動脈狹窄(CS)患者外周血內皮祖細胞(EPCs)增殖的分子機制。方法從CS患者外周血分離、培養內皮祖細胞，收集培養至第7 d的細胞，分為未處理組、AUDA組、PI3K抑制劑(LY294002)組和AUDA+ LY294002組，取無頸動脈狹窄患者的EPCs作為對照組，MTT法檢測EPCs的增殖能力，Western blot法檢測EPCs Akt磷酸化的水平。結果對照組EPCs增殖能力較未處理組增強，AUDA組較未處理組、AUDA+ LY294002組、LY294002組EPCs增殖能力增強，未處理組、AUDA+ LY294002組較LY294002組內皮祖細胞增殖能力增強；Western blot結果顯示AUDA可以促進EPCs P-Akt蛋白的表達，而LY294002可以抑制上述作用。結論AUDA可能通過活化PI3K /Akt信號通路來促進內皮祖細胞的增殖。

可溶性環氧化物水解酶抑制劑 頸動脈狹窄 內皮祖細胞 PI3K/Akt信號通路

頸動脈狹窄是缺血性腦病的常見病因之一，其中嚴重狹窄還可能因血流動力學機制而引起低灌注性腦卒中。頸動脈狹窄的主要發病機理是動脈粥樣硬化，現逐漸明確動脈壁內皮損傷是動脈粥樣硬化的始動因素之一，因此受損血管內皮細胞的修復以及再生是延緩動脈粥樣硬化的重要治療靶點[1]。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一類起源于骨髓、循環至外周血，能夠分化增殖為成熟血管內皮細胞的祖細胞。EPCs參與血管新生及損傷后內皮修復等過程，在維持內皮環境穩定中起著重要作用。循環EPCs可作為儲存庫，隨時替換功能失調的內皮細胞，從而在動脈粥樣硬化形成的最早期階段起保護作用[2]。已有研究表明，循環EPCs水平與心血管風險因子總數呈負相關，在一定程度上可以預測心腦血管不良事件發生的風險[3-5]。

環氧二十碳三烯酸( epoxyeicosatrienoic acids，EETs) 是由細胞色素 P450代謝花生四烯酸衍生的脂質化合物，是一類近幾年備受重視的具有強大生物活性的內生性脂質環氧化合物，其中EETs改善血管功能的機制主要包括促進內皮細胞增殖、調節血管緊張度和促進血管生成等[6-8]。但是EETs在細胞內半衰期短，經可溶性環氧化物水解酶( soluble epoxide hydrolase，sEH)催化成弱生物活性的二羥基衍生物。通過可溶性環氧化物水解酶抑制劑( soluble epoxidehydrolase inhibition，sEHi) 是增加細胞內EETs濃度和效用的有效途徑，AUDA[12-( 3-adamantan-1-y1-ureido ) -dodecanoic acid]是新合成的 sEHi[9]。Li等發現EETs通過誘導PI3K/Akt依賴性轉錄程序來促進造血干細胞的增殖[10]。許丹焰學者團隊發現sEHi通過PI3K/Akt信號通路正向調節冠心病患者EPCs的黏附及成血管功能[11-13]。PI3K/Akt信號通路同樣是調控EPCs增殖與凋亡等生理過程的最重要的信號轉導通路之一[2]，因而本研究主要探討AUDA對EPCs增殖的影響及其分子機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015～2016年間在湖北醫藥學院附屬太和醫院神經內科住院經全腦血管造影檢查確診有頸動脈狹窄的患者40例為頸動脈狹窄組 ( CS 組)，以同期在本院年齡、性別匹配的無頸動脈狹窄者30例作為對照組。有下列病史者予以排除:急、慢性肝腎疾病、慢性消耗性疾病及感染性疾病、冠心病、心臟瓣膜病、惡性腫瘤、外周血管病、自身免疫性疾病、血液系統疾病、重大手術或嚴重外傷等。

1.2 材料與試劑

EGM-2培養基購自Lonza公司，人纖維連接蛋白購自Millipore公司，胰蛋白酶和胎牛血清購自Gibco公司，LY294002 MTT試劑盒、AUDA、FITC標記的荊豆凝集素I(FITC-UEA-I)購自Sigma公司，Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)購自Molecular Probe公司，FITC-CD34、PE-CD133購自eBioscience公司，Akt、P-Akt抗體購自CST公司，β-Actin抗體購自Abmart公司，人淋巴細胞分離液購自天津灝洋公司。

1.3 EPCs細胞分離、培養和鑒定

所有入組對象行全腦血管造影術前在嚴格無菌條件下經鞘管從股動脈抽取動脈血30 mL，肝素抗凝，采用密度梯度離心法分離單個核細胞。人纖維連接蛋白預包被24孔細胞培養板，將單個核細胞接種在培養板中，置37 ℃，5%CO2培養箱培養，含體積分數10%胎牛血清的EGM-2完全培養基培養細胞至第4 d換液，以后隔日換液培養至第7 d，細胞與FITC-UEA-I和Dil-Ac-LDL孵育后于激光共聚焦顯微鏡下進行鑒定，FITC-UEA-I和Dil-AcLDL雙染色陽性細胞為早期EPCs。用流式細胞儀鑒定細胞表型CD34、CD133 的表達。

1.4 EPCs實驗分組

實驗分為對照組、頸動脈狹窄組(未處理組、AUDA組、AUDA+LY294002組、LY294002組)，其中AUDA為10 μmol/L、LY294002為10 μmol/L。

1.5 AUDA對EPCs增殖功能的影響

取出培養7 d的內皮祖細胞，制成單細胞懸液，將細胞密度調整至1×104個/mL；按照每孔100 μL(1×103個)接種到包被有人纖維連接蛋白96孔培養板培養8 h，加AUDA干預24 h，LY294002在加AUDA前作用2 h，每一標本做4個復孔，設空白對照，將96孔培養板移入37 ℃、5%CO2培養箱中，培養24 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，繼續培養4 h，每孔加入Formanzan溶解液培養4 h，用酶標儀于490 nm處檢測OD值。

1.6 Western Blot檢測相關蛋白表達水平

將ECPs以2×105個/mL接種于6孔板，當細胞融合達65%時加入藥物干預，48 h后收集細胞并提取蛋白，BCA法進行蛋白定量；經過電泳、轉膜后取下硝酸纖維膜，脫脂牛奶封閉1 h后以特異性一抗孵育，4 ℃過夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，進行化學發光反應并顯影、定影。將圖片掃描后用 Image J 圖像分析軟件進行蛋白灰度分析。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 研究對象臨床資料比較

2組研究對象的年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓病史、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白水平比較無明顯差異(P>0.05)(表1)。

表1 2組研究對象一般情況比較

2.2 外周血EPCs 光鏡下形態學特征

剛分離的外周血單個核細胞呈圓形，折光好，懸浮于培養液中(圖1);培養至第4 d，可見細胞貼壁長，由圓形逐漸變為短梭形(圖1); 培養至第7 d可見大量長梭形細胞，并呈“集落”樣生長，即早期 EPCs(圖1)。

2.3 雙染法鑒定EPCs

從外周血分離單個核細胞培養至第7 d，貼壁細胞與FITC-UEA-I和Dil-Ac-LDL孵育后使用激光共聚焦顯微鏡對EPCs 進行鑒定，結合FITC-UEA-I的細胞發綠色熒光，攝取Dil-Ac-LDL的細胞發紅色熒光，雙染色陽性的細胞為在分化EPCs(圖2)。

2.4 流式細胞儀鑒定EPCs 表型

外周血EPCs同時表達特異性抗原 CD34、CD133，其陽性率分別為 78.0、76.9% (圖3)。

圖1 光鏡下EPCs形態學特征(×200倍) A為剛分離出來的單個核細胞；B為培養4d的EPCs；C為培養7d的EPCs

圖2 激光共聚焦鏡下的EPCs形態學特征(×200倍) A為DAPI染色；B為FITC?UEA?1染色；C為Dil?Ac?LDL雙染色

圖3 EPCs流式細胞術檢測

2.5 AUDA及LY294002作用后對EPCs增殖功能的影響

與對照組相比，未處理組CS患者EPCs吸光度值較低(P<0.05)。與未處理組相比，AUDA單獨給藥后可以增加吸光度值(P<0.05)，預先使用LY294002作用2 h后可明顯抑制AUDA的上述作用(P<0.05)，未處理組與AUDA+LY294002組OD值未見明顯差異(P>0.05)，單獨使用LY294002后EPCs吸光度值最低(圖4)。

圖4 AUDA及LY294002作用后對內皮祖細胞增殖功能的影響

2.6 AUDA對內皮祖細胞P-Akt表達的影響

與對照組相比,未處理組CS患者早期 EPCs Akt的磷酸化水平下降(P<0.05)。與未處理組相比，AUDA作用后EPCs Akt的磷酸化水平升高(P<0.05)，預先使用LY294002作用EPCs 2 h后AUDA對 EPCs Akt磷酸化的促進作用消失(P<0.05)，未處理組與AUDA+LY294002組Akt磷酸化程度未見明顯差異(P>0.05)(圖5)。

3 討 論

腦血管病是我國致死、致殘率較高的疾病，其中頸動脈狹窄是缺血性腦血管病的常見發病原因，但是目前治療頸動脈狹窄的方法在適應癥及治療效果上均有一定的局限性[14]。近年來，EPCs因其具有參與動脈內皮損傷后修復以及促進成人新生血管的生成能力，而成為眾多學者研究的熱點。根據體外培養時間的長短可分為早期和晚期EPCs，培養5～7 d的是早期EPCs，培養2～3周為晚期EPCs。EPCs參與血管生成的機制包括以旁分泌及分化為成熟內皮細胞的方式參與血管的動態維持和生理性重建[15]。諸多研究表明EPCs在延緩動脈粥樣硬化的形成、發展以及促進梗死周圍區域新生血管的生成過程中發揮重要作用[16]。Bitterli等學者對外周血管疾病的研究中發現EPCs數量和功能在內皮功能完整性的維護中占據中心地位，并直接影響外周動脈血管中的動脈粥樣硬化的程度[17-18]。在對SD大鼠大腦中動脈閉塞模型的研究中發現經頸內動脈輸入自體外周血源性EPCs通過增加梗死區新生毛細血管的密度來減少腦梗死的面積和神經功能缺損的程度[19]。增加EPCs的數目是減少血管疾病和功能失調的重要機制之一，因此目前研究主要側重于調節內皮祖細胞功能、增殖及凋亡的途徑。有研究表明腫瘤壞死因子、脂多糖通過下調PI3K/Akt 信號通路來減少EPCs的數量；雌激素、他汀類藥物則通過上調PI3K/Akt 信號通路來促進EPCs的增殖[2]。

圖5 Westernblot檢測P?Akt/Akt表達水平 A為對照組；B為未處理組；C為AUDA+LY294002組；D為AUDA組；E為LY294002組

PI3K/Akt 信號通路是細胞內重要的信號轉導通路之一，可以通過影響下游效應分子的活化狀態，參與細胞內很多重要的生物學過程的調控，發揮著抑制細胞凋亡、促進增殖的作用。Akt是 PI3K 信號傳導通路中一個重要的下游靶激酶。PI3K 活化產生 PIP3 使 Akt 轉位到細胞膜，通過催化Akt的Ser473 和(或)Thr308 位點磷酸化而激活，引起信號通路的級聯反應[20]。

AUDA作為新一代的sEHi能夠有效地抑制sEH 將EETs分解為低活性的二羥基衍生物[8]。EETs保護心腦血管作用的機制包括降低血壓、促進內皮細胞增殖、促進血管生成、減少炎癥反應和維持血漿高密度脂蛋白的濃度等[21-22]。其中促進內皮細胞增殖的機制涉及到促進PI3K/AKt依賴的叉頭轉錄因子磷酸化，從而下調下游促凋亡蛋白的表達[23]。既往研究表明在動脈粥樣硬化患者中ox-LDL通過減少EPCs AKt的磷酸化、eNOS蛋白的表達以及促進LOX-1蛋白的表達來使EPCs的功能減弱、數量減少[2]。本研究結果顯示CS患者未處理組外周血早期 EPCs較對照組外周血早期EPCs增殖能力減弱，而AUDA單獨給藥后可以使CS患者EPCs增殖能力增強，但是在給予PI3K抑制劑LY294002以后未再觀察到AUDA對EPCs增殖能力的促進作用。通過Western blot的實驗結果得到未處理組EPCs表達的Akt的磷酸化水平較對照組低，AUDA組Akt的磷酸化水平升高，同樣在給予LY294002以后抵消了AUDA的促Akt磷酸化作用。

綜上所述，本研究認為AUDA可能部分通過活化PI3K /AKT信號通路，促進內皮祖細胞增殖，但是否有其他信號通路參與以及 Akt激活后的下游信號通路的分子機制,還需進一步研究。

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TheeffectofsolubleepoxidehydrolaseinhibitoronproliferationandPI3K/Aktsignalingpathwayinendothelialprogenitorcellsfrompatientswithcarotidstenosis

YanJing,ChenJun,AiZhibing,etal.

DepartmentofNeurology,TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000

ObjectiveTo investigate the molecular mechanism of the soluble epoxide hydrolase inhibitor (sEHi) 12-(3-adamantan-1-y1-ureido)-dodecagon acid (AUDA) in regulating the proliferation of endothelial progenitor cells (EPCs) in patients with carotid artery stenosis (CS).MethodsEPCs were isolated and cultured from the peripheral blood of CS patients,cells were collected after 7 days of culture in vitro,and all of them were divided into Untreated group,AUDA group,PI3K inhibitor LY294002 group and AUDA+ LY294002 group.The proliferation of EPCs was determined by MTT,while the expression of phosphorylated Akt in EPCs was measured by Western blot.EPCs from people without carotid artery stenosis were also cultured as the controls.ResultsThe proliferation of EPCs was stronger in the AUDA group than that in the untreated group,LY294002 group and AUDA+ LY294002 group,and the proliferation of EPCs was stronger in the untreated group and AUDA+ LY294002 group than that in the LY294002 group.Moreover，AUDA treatment increased phosphorylation of Akt,LY294002 which also blocked these effects.ConclusionThe results of the present study suggested that AUDA promoted EPCs proliferation was related to the PI3K/Akt pathway.

Soluble epoxide hydrolase inhibitor Carotid Stenosis Endothelial progenitor cell PI3K /Akt signaling pathway

R543.5

A

1007-0478(2017)05-0402-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.05.005

(2016-12-30收稿)