芬戈莫德調控小膠質細胞表型轉化對少突膠質前體細胞的影響

李瑾 樊文慧 楊園 潘鄧記

·論 著·

國家自然科學基金項目(NSFC) 81571206資助

430030 武漢，華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院神經內科

芬戈莫德調控小膠質細胞表型轉化對少突膠質前體細胞的影響

李瑾 樊文慧 楊園 潘鄧記

目的研究芬戈莫德(FTY720)對原代培養的小膠質細胞表型的影響及干預后的小膠質細胞對少突膠質前體細胞分化成熟的影響。方法體外培養原代小膠質細胞及少突膠質前體細胞(OPCs)，采用RT-PCR法檢測FTY720干預后小膠質細胞M1及M2型指標的變化；ELISA法檢測小膠質細胞上清TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-13分泌量的變化；將干預后的小膠質細胞上清液加入純化后的少突膠質前體細胞中采用Olig2與MBP共染免疫熒光染色方法觀察FTY720對少突膠質前體細胞分化成熟的影響。結果向M2型轉化；FTY720干預后的小膠質細胞促進少突膠質前體細胞的分化成熟。結論FTY720通過促進小膠質細胞向M2型轉化，從而促進少突膠質前體細胞的分化。

FTY720 小膠質細胞 表型轉化 少突膠質前體細胞

小膠質細胞是中樞神經系統中定居的巨噬細胞，是對抗損傷的第一道防線[1-2]。小膠質細胞在中樞神經系統中調節免疫和炎癥反應。對各種微環境信號小膠質細胞可以表達特定的功能反應程序，存在兩種極化狀態[3-4]，即經典(促炎，M1)型及替代(抗炎，M2)型, 參與組織的修復或損傷過程[5-7]。小膠質細胞表型主要呈現為各種細胞表面受體的表達及特定功能的可溶性細胞因子等及釋放：在LPS和IFN-γ的刺激下小膠質細胞可以極化M1型小膠質細胞(促炎型、經典激活型)，而在IL-4刺激下小膠質細胞可以極化為M2型小膠質細胞(抗炎型、替代激活型)。M1型小膠質細胞可以分泌各種炎性因子如IL-1b,IL-6,TNF-a,CCL2,及 CXCL10，還可以分泌 ROS, NO和基質金屬蛋白酶-9、基質金屬蛋白酶-3[8-12]。M1型小膠質細胞的功能是抗原提呈作用并殺傷細胞內的病原體以維持環境穩態[13]。M2型小膠質細胞表現為Arginase-1,Ym1,IGF-1,CD206等表達水平增高，主要抑制炎癥反應和發揮神經保護作用[14-15]。

芬戈莫德(Fingolimod,FTY720)作為一種口服的免疫抑制劑，被美國食品和藥物管理局批準作為多發性硬化的一線治療藥物[16]；在多發性硬化動物模型中通過促進少突膠質細胞生長、成熟及髓鞘再生而發生保護作用[17]。最近研究表明，FTY720在腦血管疾病中也可以發揮抗炎和神經保護作用[18-19]。本研究通過體外培養原代小膠質細胞及少突膠質前體細胞(OPCs)，探討FTY720對小膠質細胞表型的調控，進而觀察不同表型的小膠質細胞對少突膠質前體細胞分化成熟的影響，并探討FTY720發揮中樞神經損傷后髓鞘修復的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生0～3 d的SPF級C57乳鼠，從華中科技大學附屬同濟醫學院動物實驗中心獲得。

1.2 主要試劑 FTY720(美國Cayman生物公司)，LPS、T3(Sigma公司)，IL-4、IFN-γ，Human PDGF-AA，Mouse-FGF-Basic、Mouse-CNTF(Peorotech公司)，N2 supplement(100×)，B27supplement (50×)(GIBCO公司)，DMEM/F12細胞培養基，DMEM/F12高糖培養基(Hyclone公司)，胎牛血清(四季青公司)，多聚 L- 賴氨酸(PLL，Sigma 公司),兔抗小鼠Olig2多克隆抗體(Millipore 公司)，兔抗 Iba-1 單克隆抗體(wako 公司)，大鼠抗 MBP 單克隆抗體小鼠(Millipore 公司)，IL-1β，TNF-α，TGF-β ELISA檢測試劑盒(深圳達科為公司)，小鼠IL-13 ELISA檢測試劑盒購自(Abcam公司)，Trizol Reagent(Invitrogen 公司)，逆轉錄 kit、SYBR gene PCR Master Mix (TOYOBO公司)，引物GAPDH(武漢谷歌生物公司)。

1.3 Real-time PCR引物見表1

1.4 方法

1.4.1 混合膠質細胞原代培養 根據文獻[24-25]方法改進，原代培養小鼠小膠質細胞及少突膠質前體細胞。取出生0～3 d的C57乳鼠，在無菌條件下取出小鼠全腦，去腦膜和血管，PBS液沖洗后留大腦半球及中腦，保留胼胝體，放入預先已加入2 mL PBS液中，剪碎后加入2 mL 0.25%的胰酶，在37 ℃條件下消化15 min，用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，終止消化后用200目鋼絲篩網過濾細胞懸液，800 r/min 4 ℃離心過濾后的細胞懸液8 min，棄去上清后用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養基重懸沉淀的細胞，按照106密度將細胞懸液接種于T75細胞培養瓶中，95% O2、5% CO2的37 ℃培養箱培養，每3～4 d換液1次(更換為含20%胎牛血清DMEM/高糖培養基)，當細胞100%匯合后進行下面的分離純化步驟。

1.4.2 小膠質細胞及少突膠質前體細胞的分離純化 原代培養的混合膠質細胞長滿后擰緊瓶蓋，放到恒溫水平搖床上振搖純化小膠質細胞，37 ℃下250 r/min震搖1.5 h,取振搖后的細胞上清4 ℃ 800 r/min離心8 min,棄上清，用含20%胎牛血清的DMEM/高糖培養基重懸細胞，接種于6孔培養板或鋪有蓋玻片(多聚賴氨酸包被)24孔板中，用于下游實驗。分離后的小膠質細胞使用Iba1(1∶200)抗體進行免疫熒光法檢測純度。按上述方式純化小膠質細胞后更換培養基，繼續37 ℃恒溫搖床振搖(180 r/min,18 h)，然后按照差速貼壁方法去除多余的星形膠質細胞及小膠質細胞，后將懸浮細胞800 r/min 4 ℃離心8 min,棄上清，用OPCs培養基重懸細胞沉淀，細胞按2×105密度接種于鋪有用多聚賴氨酸包被過的蓋玻片的24孔板中，分離后的OPCs細胞使用Olig2(1∶200)抗體進行免疫熒光法檢測純度。純化3 d后的OPCs細胞更換為分化培養基及干預培養基，誘導分化3 d，收集細胞爬片用于免疫熒光染色。

表1 Real-time PCR引物

1.4.3 小膠質細胞及少突膠質前體細胞的干預 (a)純化后的小膠質細胞種植于6孔板中24 h后按如下分組進行干預：未刺激組(M0組)，LPS+IFNγ組(M1組)，LPS plus IFNγ+FTY720組,IL-4組(M2組)，干預24 h后收集細胞及細胞上清用于下游實驗;(b)純化3 d后的OPCs細胞用干預后的小膠質細胞上清(MG培養基)和OPCs分化培養基(比例為1∶1)培養3 d,分組如下：OPCs分化培養基組；M0小膠質細胞上清液+OPCs分化培養基；M1小膠質細胞上清液+OPCs分化培養基；M1+FTY720小膠質細胞上清液+OPCs分化培養基；M1小膠質細胞上清液+單獨預處理后的FTY720培養基+OPCs分化培養基；M2小膠質細胞上清液+OPCs分化培養基,OPCs細胞干預3 d后收集細胞爬片用于免疫熒光染色。

1.4.4 免疫熒光染色 干預后的小膠質細胞及OPCs細胞，按以前的方法[26],棄去上清，以4%多聚甲醛固定15 min后用0.25%Triton X-100破膜液室溫破膜15 min，再用封閉液(PBS含1%BSA，0．1%Triton)室溫下封閉60 min，加入兔抗小鼠Iba1抗體(1∶200)、兔抗小鼠Olig2抗體(1∶200)、大鼠抗小鼠MBP抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜，用PBS洗3遍，每遍10 min，之后以相應的二抗(Cy3 標記的山羊抗兔 IgG、Cy3 標記的山羊抗大鼠 IgG、FITC 標記的驢抗兔 IgG 1∶200)室溫下避光孵育1 h，PBS洗3遍，每遍10 min；DAPI染色10 min，PBS洗3遍，每遍10 min；甘油封片，熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.4.5 RT-PCR 小膠質細胞干預24 h后棄去培養基，按照先前的方法[27]用Trizol 溶液裂解細胞提取RNA。提取出的RNA按照逆轉錄試劑盒說明書方法將RNA逆轉錄為cDNA,然后將逆轉錄出的cDNA用實時熒光定量試劑盒檢測 mRNA的表達水平，以三磷酸甘油醛脫氫酶(GADlPH)作為內參對照。反應參數：94 ℃預變性10 min;(94 ℃變性45 S，56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s)×35個循環：72 ℃延伸10 min。每個樣本設置3個復孔，CT值代表熒光實時定量PCR的水平，△CT =CT(目的基因)-CT(內參基因)，ΔΔCT=ΔCT(實驗組)-△CT(對照組)。根據公式可以算出各組細胞中目的基因表達/對照組細胞中目的基因表達=2-ΔΔCT[28]。

1.4.6 ELISA 小膠質細胞干預24 h后收集細胞上清液，按照試劑盒說明書檢測上清液中炎性因子TNF-α、TGF-β、IL-13、IL-1β的表達水平，顯色后在酶標儀450 nm處測吸光度值，建立標準曲線，根據標準曲線計算表達水平。

1.4.7 統計學處理法

采用實驗數據用均數±標準誤(Mean±SEM)表示,SPSS19.0進行單因素方差分析及 t檢驗，組間比較用 SNK 法。以P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 小膠質細胞及少突膠質前體細胞的鑒定

采用Iba1與DAPI免疫熒光共染法鑒定小膠質細胞的純度顯示小膠質細胞的純度可達99%；Olig2與DAPI免疫熒光共染法鑒定OPCs的純度顯示OPCs的純度可達95%(圖1)。

圖1 免疫熒光雙標染色技術鑒定小膠質細胞及OPCs的純度 A為Iba1與DAPI共染鑒定小膠質細胞純度；B為Olig2與DAPI共染鑒定OPCs純度

2.2 FTY720在體外細胞實驗中對小膠質細胞表型的影響

通過RT-PCR檢測顯示：LPS+IFNγ+FTY720干預較LPS+IFNγ刺激組的M1型小膠質細胞生物學標志物iNOS，CD86，TNF-α,CD32及IL-1β 的mRNA表達水平低，LPS+IFNγ+FTY720干預較LPS+IFNγ刺激組M2型小膠質細胞生物學標志物Arg 1,CD206,YM,IL-10，TGF-β 的mRNA表達水平高；與IL-4組比較，這2組的M1型小膠質細胞生物學標志物mRNA表達水平都較之要高，而M2型小膠質細胞生物學標志物的mRNA表達水平較之要低(P<0.05或P<0.01)(表2)。

表2 在體外細胞實驗中 FTY720干預后小膠質細胞細胞表型的變化(Mean±SEM，pg/mL)

注：與LPS+IFN-γ組比較，*P<0.05，▲P<0.01

2.3 FTY720在體外細胞實驗中對小膠質細胞上清液炎性因子表達水平的影響

LPS+IFNγ+FTY720干預較LPS+IFNγ刺激組的炎性細胞因子TNF-α，IL-1β表達水平顯著降低，炎性細胞因子TGF-β，IL-13表達水平顯著增高(P<0.05或P<0.01)(表3)。

2.4 小膠質細胞表型轉化對少突膠質細胞前體細胞分化成熟的影響

M1(LPS+IFN-γ)+FTY720干預后的小膠質細胞條件培養基后的0PCs分化較用M1型小膠質細胞條件培養基干預的OPCs分化增多，提示FTY720通過促進M1型小膠質細胞向M2型小膠質細胞轉化而促進OPCs的分化(圖2，表4)。

圖2 在體外細胞實驗中FTY720干預后的小膠質細胞對OPCs分化成熟的影響(MBP與Olig2免疫熒光雙標染色)

表3 在體外細胞實驗中 FTY720干預后小膠質細胞上清釋放的炎性因子表達水平的改變(Mean±SEM，pg/mL)

注：與LPS+IFN-γ組比較，*P<0.01，▲P<0.01，#P<0.05

表4 在體外細胞實驗中 FTY720干預后的小膠質細胞對OPCs分化成熟的影響(Mean±SEM，%)

注：與Control組比較，*P<0.01；與LPS+IFN-γ組比較，▲P<0.01

3 討 論

神經炎癥被認為是慢性腦灌注不足動物模型中白質損傷的關鍵病理生理學[22]，小膠質細胞在腦白質損傷中是一把雙刃劍，在中樞神經系統中調節免疫和炎癥反應。小膠質細胞存在兩種極化狀態[3-4],即經典(促炎，M1)型及替代(抗炎，M2)型，通過產生促炎/抗炎因子而發揮神經損傷/保護作用。

有研究表明芬戈莫德(FTY720)通過防止淋巴細胞從淋巴結中排出而減少循環淋巴細胞的數量，并且可能有助于防止淋巴細胞早期浸潤到腦中以及抑制小膠質細胞和巨噬細胞的局部活化。

本研究通過體外培養原代小膠質細胞和少突膠質前體細胞(OPCs)，再通過LPS+IFN-γ刺激純化后的小膠質細胞促使小膠質細胞活化為經典的M1型，用FTY720干預后通過RT-PCR技術檢測小膠質細胞表型標記物顯示FTY720干預后小膠質細胞的M1型標志物減少而M2型標志物增多，表明FTY720促使小膠質細胞向M2型轉化。采用ELISA法檢測小膠質細胞上清液中的炎性因子的表達水平，結果顯示FTY720干預后炎性因子TNF-α，IL-1β的分泌減少，而TGF-β,IL-13的分泌增多。說明FTY720可以減少炎性因子的釋放,增多抗炎性因子的釋放，減輕了神經炎癥反應。將小膠質細胞上清液加到純化后的少突膠質前體細胞(OPCs)中干預3 d后采用免疫熒光染色方法探討FTY720干預后小膠質細胞對OPCs的影響，結果顯示FTY720干預后的小膠質細胞上清液促進OPCs的分化成熟，從而減輕腦白質的損傷。以上研究結果表明小膠質細胞的表型轉化對少突膠質前體細胞(OPCs)的分化成熟有影響。但是關于影響小膠質細胞表型轉化進而影響少突膠質細胞的機制尚不清晰，所以還需要進一步實驗探討。

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TheeffectofFingolimod-mediatedmicroglialpolarizationonoligodendrocyteprecursorcells

LiJin,FanWenhui,YangYuan,etal.

DepartmentofNeurology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030

ObjectiveTo investigate the effect of S1P receptor agonist Fingolimod (FTY720) on microglial polarization and the effect of FTY720-mediated microglia polarization on maturation of oligodendrocyte precursor cells.MethodsRT-PCR was used to examine the polarization of microglia in vitro. ELISA was used to detect the supernatant of microglial cells in order to measure the levels of TNF-α, TGF-β, IL-1β and IL-13. The supernatant of microglial cells was added to the purified oligodendrocyte precursor cells, and then the differentiation of oligodendrocyte precursor cells was detected by immunofluorescence staining.ResultsFTY720 promoted the microglia toward M2 polarization, promotes differentiation of oligodendrocyte.ConclusionFTY720 promoted the differentiation of oligodendrocyte precursor cells by promoting the microglia toward M2 polarization.

FTY720 Microglial polarization Oligodendrocyte precursor cells

R742

A

1007-0478(2017)05-0383-06

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.05.001

(2017-02-05收稿)