環(huán)境中微生物原位檢測方法研究進(jìn)展

宋偉鳳 李明聰 高崢

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 作物生物學(xué)國家重點實驗室，泰安271000）

環(huán)境中微生物原位檢測方法研究進(jìn)展

宋偉鳳 李明聰 高崢

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 作物生物學(xué)國家重點實驗室，泰安271000）

微生物是生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動的主要參與者，在生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用。但在現(xiàn)有技術(shù)條件下可培養(yǎng)微生物所占比例極小，限制了微生物資源的開發(fā)利用。目前有許多方法，可以避開微生物不可培養(yǎng)的問題，直接對微生物進(jìn)行原位檢測。對此，將前人關(guān)于微生物生態(tài)的原位檢測研究方法進(jìn)行了綜述，方便以后對這些方法的合理應(yīng)用。分別從DNA水平、RNA水平和蛋白質(zhì)水平，介紹了對應(yīng)的原位微生物檢測方法（如BrdU標(biāo)記、DNA-SIP、FISH和環(huán)境轉(zhuǎn)錄物組等），比較了它們的優(yōu)缺點，并介紹了如何將這些方法與目前流行的高通量測序、單細(xì)胞測序等技術(shù)相結(jié)合來捕獲原位活性微生物組等。同時，還對這些方法的特點進(jìn)行了比較，使得人們可以更清楚地了解在不同場景下對不同方法的選擇。這些經(jīng)過改進(jìn)的新興方法及其與其它方法的結(jié)合使用將有助于解決微生物生態(tài)學(xué)研究中出現(xiàn)過或即將出現(xiàn)的很多問題。地球上的各種生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜而龐大，包含的微生物種群也各有差異。各種原位檢測方法對微生物生理生態(tài)做出了更加真實有效的描述，必將成為研究微生物生態(tài)的有力手段。

微生物原位檢測；BrdU標(biāo)記；DNA-SIP；熒光原位雜交；宏基因組；轉(zhuǎn)錄物組；生物正交反應(yīng)

微生物是生物地球化學(xué)循環(huán)的驅(qū)動者，在生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要角色［1］。微生物多樣性是微生物生態(tài)學(xué)研究的重要內(nèi)容，是人們認(rèn)識、開發(fā)和利用微生物資源的前提和基礎(chǔ)，對了解微生物與環(huán)境互作具有重要意義。早期的微生物多樣性研究需要通過純培養(yǎng)獲得菌株后才能對其特性進(jìn)行描述［2］，可實際上培養(yǎng)得到的只是自然環(huán)境中的少部分微生物（0.001%-15%）［3］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，直接利用環(huán)境樣品的總DNA進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴增并進(jìn)行鑒定，開辟了將分子生物學(xué)技術(shù)直接應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究的新紀(jì)元［4］，解決了環(huán)境中未培養(yǎng)微生物研究的難題。然而傳統(tǒng)的16S擴增子測序［5］、宏基因組測序［6］和單細(xì)胞基因組測序［6］雖然對微生物群落的分布模式及潛在功能鑒定提供了重要依據(jù)，卻不能對其在環(huán)境變化的動態(tài)響應(yīng)進(jìn)行完全檢測［6］。隨著研究的深入，越來越多的研究者選擇使用原位微生物活性檢測與測序組學(xué)相結(jié)合的方法，對環(huán)境中活性微生物的豐度、多樣性、群落結(jié)構(gòu)、功能代謝及環(huán)境響應(yīng)能力進(jìn)行研究［7］。本文綜述了現(xiàn)有的常用于微生物檢測的一些方法，這些方法可以增加人們對微生物群落成員的不同生態(tài)和生理的了解，為人們提供了原位微生物生態(tài)群落對環(huán)境變化響應(yīng)的新視角。以下是我們對這一領(lǐng)域中新興技術(shù)前景的探討。

1 微生物原位檢測的常用方法

1.1 基于DNA水平的微生物原位檢測方法

DNA 復(fù)制是細(xì)胞生命周期中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，利用胸苷的類似物進(jìn)入新合成的 DNA 進(jìn)行檢測一直是研究 DNA 代謝的有效方法［8］。5'-溴脫氧尿苷（BrdU）標(biāo)記技術(shù)是最早開發(fā)的可以原位標(biāo)記活性樣品并能結(jié)合組學(xué)測序的方法。其原理是利用BrdU在細(xì)胞增殖時期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復(fù)制的DNA（和RNA）分子中，隨后進(jìn)行密度梯度離心或者免疫學(xué)方法捕獲被BrdU標(biāo)記的DNA/RNA［9］。BrdU標(biāo)記法已經(jīng)成功應(yīng)用于多種環(huán)境中微生物分子生態(tài)學(xué)的研究。目前，研究者們主要針對細(xì)菌、古菌和真菌在不同環(huán)境刺激下DNA合成活性的變化進(jìn)行了研究，研究內(nèi)容包括森林土壤樣品中不同碳源刺激下細(xì)菌活性的變化［10］，不同植物接種后叢枝菌根真菌后的反應(yīng)［11］，阿拉斯加北部森林樣品中氮添加后微生物活性群落的變化［12］，土壤中活性微生物對不同碳源的反應(yīng)［9-13］等。雖然BrdU標(biāo)記實驗可以用來檢測微生物在各種環(huán)境刺激條件下的活性反應(yīng)，但目前發(fā)現(xiàn)的BrdU標(biāo)記技術(shù)與高通量測序結(jié)合的應(yīng)用是十分有限的［14-16］。Hamasaki等［16］通過BrdU標(biāo)記及454高通量測序?qū)μ窖竽媳睓M斷面海水樣品中活性微生物的物種組成進(jìn)行了研究，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于環(huán)境過濾，微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了動態(tài)變化，活躍的細(xì)菌群體更加多樣化。然而，由于標(biāo)記效率較低，需要相對大量的樣品，以獲取測序所需要的DNA量，這使得這種技術(shù)相對昂貴且需要大量勞動力。并且由于不同生物細(xì)胞的吸收速率不同，重復(fù)性不高，也影響了該技術(shù)的普遍應(yīng)用。

穩(wěn)定性同位素核酸探針技術(shù)（DNA-based stable isotope probing，DNA-SIP），是采用穩(wěn)定性同位素示蹤復(fù)雜環(huán)境中微生物基因組DNA的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)［17］。利用穩(wěn)定性同位素示蹤復(fù)雜環(huán)境中微生物基因組DNA，實現(xiàn)了由單一微生物生理過程研究向微生物群落生理生態(tài)研究的轉(zhuǎn)變，能在更高更復(fù)雜的整體水平上定向發(fā)掘重要微生物資源，推動微生物生理生態(tài)的發(fā)展。DNA-SIP分析的原理是通過將同位素穩(wěn)定的結(jié)合到特定的底物上來確定環(huán)境中微生物的作用。除磷以外，幾乎所有具有生物學(xué)意義的元素均有2 種以上的穩(wěn)定性同位素，而且不同同位素組成的化合物通常具有相同的物理化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)，所以微生物可以利用不同的穩(wěn)定性同位素來進(jìn)行生長繁殖［17］。Radajewski等［18］將這種方法應(yīng)用于土壤微生物的甲醇利用的研究，隨后確定了有活性的甲基營養(yǎng)型，發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)型局限于α-變形菌和乳桿菌屬，這是這種方法的首次應(yīng)用。最近，Dumont等［19］從湖泊沉積物的甲烷氧化菌中得到了13CH4標(biāo)記的RNA宏轉(zhuǎn)錄組序列，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的宏轉(zhuǎn)錄組序列主要集中于甲基球菌科和甲烷單加氧酶（pmoCAB）基因的轉(zhuǎn)錄組序列中。但是，這種方法也受到了許多的限制。例如，孵育時間較長，交互共生問題，容易發(fā)生污染，依賴于商用標(biāo)記化合物，潛在的富集偏向性等。近年來，隨著SIP技術(shù)的逐漸成熟和不斷優(yōu)化，其應(yīng)用范圍也不斷擴展，與其他技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用也使得DNA-SIP成為重要種群DNA合成序列分析的最好的方法。Huang等［20］將SIP與拉曼光譜和熒光原位雜交技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行原位雜交，對單個細(xì)胞的特性和功能進(jìn)行了分析。到目前為止，關(guān)于DNA-SIP 與宏基因組學(xué)結(jié)合的研究報道還很少，但從這些研究中可以看出它比傳統(tǒng)宏基因組學(xué)具有更大的優(yōu)勢，通過運用DNA-SIP 可以提高新酶類發(fā)現(xiàn)的概率，也可以減少鳥槍測序法很難解決種群復(fù)雜的問題。

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)，該技術(shù)是以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法。1980 年，Roumam等［21］首次報道了用熒光素標(biāo)記的cDNA 進(jìn)行的原位雜交，自那以后，F(xiàn)ISH逐漸成為在環(huán)境生物學(xué)中最常用的方法之一。作為一種非放射性的檢測系統(tǒng)，F(xiàn)ISH 技術(shù)有其特有的屬性和優(yōu)點：（1）熒光試劑和探針經(jīng)濟、安全；（2）探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；（3）實驗周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；（4）FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；（5）多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多條序列；（6）既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。盡管如此，這種方法也有缺點：因為細(xì)胞內(nèi)的靶定分子數(shù)量較少，探針在細(xì)胞內(nèi)的滲透性差，雜交效率低，所以可以被檢測的靈敏度不高。這極大程度的限制了這種方法的應(yīng)用，所以人們想出了很多方法來克服這個問題。其中催化信使沉積法熒光原位雜交（CARD-FISH）的效果最好。CARD的原理是在過氧化氫存在的前提下，辣根過氧化氫酶（HRP）將其轉(zhuǎn)化成一個酪胺中間體的自由基，這種酪胺可以在細(xì)胞或阻斷試劑中與芳香族化合物進(jìn)行非特異性反應(yīng)，這種反應(yīng)只發(fā)生在HPR附近，而且時間很短，最終HPR分子周圍會沉積大量的酪胺，從而獲得較強的檢測信號［22］。CARD最早是作為放大免疫分析信號的新方法被提出來的［23-24］。1995年，Kerstens等［25］將其應(yīng)用于熒光原位雜交的信號增強中，取得了良好的效果。Kawakami等［26］通過雙通路CARD-FISH技術(shù)檢測并標(biāo)記到了mcrA基因；Moraru等［27］使用CARD-FISH和雙鏈DNA探針檢測到了海水樣品中的泉古菌amoA基因；Kenzaka等［28］將CARD-FISH與納米金標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合，檢測到了質(zhì)粒上的綠色熒光基因和氨芐青霉素耐藥基因。總體來說，熒光原位雜交技術(shù)能夠?qū)⑽⑸锃h(huán)境中的完整細(xì)胞景象的信息進(jìn)行再現(xiàn)還原，精確度較高，因此在現(xiàn)在的微生物多樣性的研究領(lǐng)域中被廣泛的應(yīng)用。

宏基因組也稱環(huán)境微生物基因組或元基因組，是指環(huán)境中全部微小生物（目前主要包括細(xì)菌和真菌）DNA的總和。宏基因組學(xué)誕生于20世紀(jì)90年代，是指不經(jīng)過微生物培養(yǎng)階段，直接提取環(huán)境中總DNA，對微生物基因總和進(jìn)行研究的一門學(xué)科。1998 年，Handelsman［29］首次提出了宏基因組（Metagenome）概念，認(rèn)為應(yīng)該針對環(huán)境樣品中細(xì)菌和真菌的基因組總和進(jìn)行研究。2006年，Leininger等［30］首次將高通量測序技術(shù)應(yīng)用于土壤中微生物群體的研究發(fā)現(xiàn)，古菌在土壤原核氨氧化生物中占優(yōu)勢。2008年，F(xiàn)rias-Lopez等［31］又將該技術(shù)應(yīng)用于對海洋中微生物群落的研究中。隨著宏基因組等技術(shù)的發(fā)展，其他技術(shù)與宏基因組技術(shù)的結(jié)合使用將有效改善這些問題。Kalyuzhnaya等［32］利用高通量快速測序研究華盛頓湖淤泥的碳循環(huán)，他們用13C復(fù)合物進(jìn)行DNA-SIP 實驗，隨后利用純化的標(biāo)記DNA 建立宏基因組庫，通過回收的13C-DNA 宏基因組庫序列幾乎重建了嗜甲基菌Methylotenera mobilis的完整染色體組。總之，全基因組鳥槍測序的宏基因組學(xué)方法可重建低豐度微生物的基因組和新陳代謝通路，但前提是需要結(jié)合DNA-SIP 技術(shù)。

同時，峰谷比（PTR）也可以用來檢測微生物活性。峰谷比是一種可以在不同的生長條件和復(fù)雜的細(xì)菌群落中，提供一個定量的體內(nèi)和體外生長速率測量方法的技術(shù)。該技術(shù)由Korem等［33］首次發(fā)現(xiàn)，隨后Brown等［34］開發(fā)了復(fù)制指數(shù)（iRep）可以改進(jìn)PRT技術(shù)。這個技術(shù)需要提供被檢測微生物的復(fù)制起點信息，并需要根據(jù)實際情況，進(jìn)行人工校正，目前使用并不廣泛。

1.2 基于RNA水平的微生物原位活性檢測方法

RNA-SIP是與DNA-SIP基本相同的一種分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，采用穩(wěn)定性同位素追蹤環(huán)境中微生物的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA。其原理和優(yōu)缺點與DNA-SIP完全相同。

轉(zhuǎn)錄組測序能夠全面快速的獲取某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息。轉(zhuǎn)錄組在廣義上是指某一生理條件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，在狹義上則是指所有mRNA的集合。與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組的定義中包含了時間和空間的限定。同一細(xì)胞在不同的生長時期及生長環(huán)境下，其基因表達(dá)情況是不完全相同的。轉(zhuǎn)錄組學(xué)以微生物的全部mRNA為研究對象，所以會存在一些問題，如mRNA的含量較低，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定容易被降解等。隨著新一代測序技術(shù)的產(chǎn)生，RNA-Seq（High-throughput RNA sequencing）隨之而來，轉(zhuǎn)錄組學(xué)也得到了飛速的發(fā)展。Voorhies等［35］通過通過對休倫湖島中污水池的藍(lán)藻團進(jìn)行宏基因組分析和環(huán)境轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，推斷出了藍(lán)藻和病毒的生態(tài)與遺傳的互作關(guān)系。De Filipps等［36］通過環(huán)境轉(zhuǎn)錄組學(xué)對微生物對奶酪成熟速率的影響進(jìn)行了研究，揭示了在溫度推動下微生物的功能變化。為了了解導(dǎo)致大分子顆粒形成厭氧氨氧化生長增值機制，Bagchi等［37］結(jié)合環(huán)境轉(zhuǎn)錄組學(xué)、定量PCR和16S rRNA基因測序，對厭氧氨氧化顆粒狀生物反應(yīng)器中的群落組成、代謝基因組成和表達(dá)變化進(jìn)行了分析，并提出了大顆粒形成的概念模型，這有助于今后采用厭氧氨氧化工藝進(jìn)行廢水處理。相信在未來的發(fā)展中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)將會更好的與其他技術(shù)相結(jié)合，在生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域獲得更加廣泛的應(yīng)用。

1.3 基于氨基酸生物合成的微生物原位活性的檢測

生物正交反應(yīng)（Bioorthogonal reaction）是指一類可以在活體細(xì)胞中進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)。這類反應(yīng)可以在生物體內(nèi)的生理條件下發(fā)生，不會與體內(nèi)同時發(fā)生的其他生化反應(yīng)互相干擾，也不會對生物體和目標(biāo)生物分子產(chǎn)生損傷。要完成生物正交反應(yīng)，首先需要有可以參與正交反應(yīng)的一對官能團，將其中一個參與正交反應(yīng)的官能團引入目標(biāo)蛋白；另一個參與反應(yīng)的官能團與標(biāo)記物進(jìn)行連接，然后將兩者進(jìn)行正交反應(yīng)，最后利用不同標(biāo)記物的特性對目標(biāo)蛋白的定位、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行檢測［38］。前期研究表明，生物正交非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸標(biāo)記（Bioorthogonal noncanonicalamino acid tagging，BONCAT） 技 術(shù)能對環(huán)境中功能微生物蛋白進(jìn)行能有效地標(biāo)記。Hatzenpichler等［39］用深海沉積物樣品富集好氧嗜甲烷菌群，通過BONCAT標(biāo)記確定其富集物主導(dǎo)類群為γ變形菌門的甲基球菌屬，這些甲基球菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活性被認(rèn)為依賴于富集培養(yǎng)時甲烷的添加。利用這種方法可以有針對性地研究在實驗條件發(fā)生改變時特殊的標(biāo)記蛋白所做出的反應(yīng)。但這種方法在傳統(tǒng)意義上來說，也只能用來研究某種生物的蛋白質(zhì)組，一些新興的技術(shù)將這種方法與其他方法耦合，希望能夠使得這種方法得到更廣泛的應(yīng)用。Hatzenpichler等［7］將BONCAT與FACS結(jié)合，應(yīng)用于甲烷厭氧氨氧化的研究中，對甲烷氧化菌的翻譯活性進(jìn)行了分類，并通過全基因組測序和16S RNA測序發(fā)現(xiàn)了一個新的古菌-細(xì)菌互作組合。這項技術(shù)與高通量技術(shù)的結(jié)合使用也展現(xiàn)出了非常好的前景，將有助于在微米分辨率下監(jiān)測細(xì)胞翻譯活動對環(huán)境信號的響應(yīng)，并擴大高通量測序的尺度。當(dāng)然，BONCAT也存在一定的局限性，如環(huán)境氨基酸吸收機制的多樣性，添加的氨基酸的潛在影響等。希望在未來的改進(jìn)或與其他技術(shù)結(jié)合后，能夠有效地消除或減少這些限制性條件的影響。

2 選擇合適的方法來檢測原位微生物

微生物活性檢測的結(jié)果，是由選擇的方法和獲取的參數(shù)產(chǎn)生的。在研究微生物在某一過程中所起到的作用時，我們無法對每一個細(xì)節(jié)都進(jìn)行完整的評價，但也不可以僅僅在系統(tǒng)水平上進(jìn)行概括性描述。所以，在我們設(shè)計相關(guān)的實驗時，要將實際時間和空間條件的限制與各種待選方法的特性綜合考慮，根據(jù)各種限制因素選擇合適的方法來檢測原位微生物（各方法比較詳見表1）。在對微生物研究的過程中通常會面臨一個非常重要的挑戰(zhàn)，即確定微生物能產(chǎn)生作用的范圍［44］，因為微生物產(chǎn)生影響的范圍會決定檢測方法的選擇。例如，基于單細(xì)胞水平的檢測技術(shù)不能為系統(tǒng)水平的鑒定與分類提供足夠的數(shù)據(jù)支撐。因為選擇不同檢測方法對各種微生物細(xì)胞的分類可能會產(chǎn)生影響，所以在對實驗設(shè)計進(jìn)行評價之前，應(yīng)該對每種檢測方法進(jìn)行評估，以確定特定種類的微生物群落所需要的研究方法。

表1 微生物原位檢測方法的特征對比

3 展望

微生物生態(tài)學(xué)自產(chǎn)生以后，經(jīng)過許多前輩的探索與發(fā)展，已經(jīng)克服了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的限制，形成了一些比較系統(tǒng)的研究方法，使得我們對各種生態(tài)系統(tǒng)的了解更加的深入。隨著各種檢測方法的發(fā)展完善，檢測結(jié)果會更加精確，這會讓認(rèn)識更加明確。同時檢測費用的逐漸降低，也會讓各種檢測方法的使用更加廣泛。地球上的各種生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜而龐大，包含的微生物種群也各有差異。各種原位檢測方法對微生物生理生態(tài)做出了更加真實有效的描述，必將成為研究微生物生態(tài)的有力手段。

［1］Canfield DE, Glazer AN, Falkowski PG. The evolution and future of Earth’s nitrogen cycle［J］. Science, 2010, 330（6001）：192-196.

［2］ Anderson IC, Cairney JWG. Diversity and ecology of soil fungal communities：increased understanding through the application of molecular techniques［J］. Environ Microbiol, 2004, 6（8）：769-779.

［3］ Schleifer KH. Microbial diversity：facts, problems and prospects［J］. Systematic and Applied Microbiology, 2004, 27（1）：3-9.

［4］Pace NR, Stahl DA, Lane DJ, et al. Analyzing natural microbial populations by rRNA sequences［J］. ASM American Society for Microbiology News, 1985, 51（1）：4-12.

［5］Tringe SG, Hugenholtz PA renaissance for the pioneering 16S rRNA gene［J］. Current Opinion in Microbiology, 2008, 11（5）：442-446.

［6］Handelsman J. Metagenomics：application of genomics to uncultured microorganisms［J］. Microbiology and Molecular Biol Rev, 2005, 69（1）：195-195.

［7］Hatzenpichler R, Connon SA, Goudeau D, et al. Visualizing in situ translational activity for identifying and sorting slow-growing archaeal- bacterial consortia［J］. Proc Natl Academy of Sciences,2016, 113（28）：E4069-E4078.

［8］Biggs MJP, Richards RG, Dalby MJ. Using immuno-scanning electron microscopy for the observation of focal adhesion-substratum interactions at the nano-and microscale in S-phase cells［J］. 3D Cell Culture：Methods and Protocols, 2011：53-60.

［9］Urbach E, Vergin KL, Giovannoni SJ. Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria［J］. Appl Environ Microbiol, 1999, 65（3）：1207-1213.

［10］Yin B, Crowley D, Sparovek G, et al. Bacterial functional redundancy along a soil reclamation gradient［J］. Appl Environ Microbiol, 2000, 66（10）：4361-4365.

［11］Artursson V, Finlay RD, Jansson JK. Combined bromodeoxyuridine immunocapture and terminal-restriction fragment length polymorphism analysis highlights differences in the active soil bacterial metagenome due to Glomus mosseae inoculation or plant species［J］. Environ Microbiol, 2005, 7（12）：1952-1966.

［12］Allison SD, Czimczik CI, Treseder KK. Microbial activity and soil respiration under nitrogen addition in Alaskan boreal forest［J］.Global Change Biology, 2008, 14（5）：1156-1168.

［13］Goldfarb KC, Karaoz U, Hanson CA, et al. Differential growth responses of soil bacterial taxa to carbon substrates of varying chemical recalcitrance［J］. Frontiers in Microbiology, 2011, 2.

［14］Mou X, Sun S, Edwards RA, et al. Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean［J］. Nature, 2008, 451（7179）：708-711.

［15］David MM, Cecillon S, Warne BM, et al. Microbial ecology of chlorinated solvent biodegradation［J］. Environ Microbiol, 2015,17（12）：4835-4850.

［16］Hamasaki K, Taniguchi A, Tada Y, et al. Active populations of rare microbes in oceanic environments as revealed by bromodeoxyuridine incorporation and 454 tag sequencing［J］.Gene, 2016, 576（2）：650-656.

［17］ 賈仲君. 穩(wěn)定性同位素核酸探針技術(shù) DNA-SIP 原理與應(yīng)用［J］.微生物學(xué)報, 2011, 51（12）：1585-1594.

［18］ Radajewski S, Ineson P, Parekh NR, et al. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology［J］. Nature, 2000, 403（6770）：646-649.

［19］ Dumont MG, Pommerenke B, Casper P. Using stable isotope probing to obtain a targeted metatranscriptome of aerobic methanotrophs in lake sediment［J］. Environ Microbiol Reports, 2013, 5（5）：757-764.

［20］ Huang WE, Stoecker K, Griffiths R, et al. Raman-FISH ：combining stable-isotope Raman spectroscopy and fluorescence in situ hybridization for the single cell analysis of identity and function［J］. Environ Microbiol, 2007, 9（8）：1878-1889.

［21］ Bauman JG J, Wiegant J, Borst P, et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome-labelled RNA［J］.Experimental Cell Research, 1980, 128（2）：485-490.

［22］Kubota K. CARD-FISH for environmental microorganisms：technical advancement and future applications［J］. Microbes and Environments, 2013, 28（1）：3-12.

［23］Bobrow MN, Harris TD, Shaughnessy KJ, et al. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification application to immunoassays［J］. Journal of Immunological Methods, 1989, 125（1）：279-285.

［24］Bobrow MN, Shaughnessy KJ, Litt GJ. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification：II. Application to membrane immunoassays［J］. Journal of Immunological Methods, 1991, 137（1）：103-112.

［25］ Kerstens HM, Poddighe PJ, Hanselaar AG. A novel in situ hybridization signal amplification method based on the deposition of biotinylated tyramine［J］. Journal of Histochemistry &Cytochemistry, 1995, 43（4）：347-352.

［26］Kawakami S, Kubota K, Imachi H, et al. Detection of single copy genes by two-pass tyramide signal amplification fluorescence in situ hybridization（Two-Pass TSA-FISH）with single oligonucleotide probes［J］. Microbes and Environments, 2010, 25（1）：15-21.

［27］Kawakami S, Kubota K, Imachi H, et al. Detection of single copy genes by two-pass tyramide signal amplification fluorescence in situ hybridization（Two-Pass TSA-FISH）with single oligonucleotide probes［J］. Microbes and Environments, 2010, 25（1）：15-21.

［28］Kenzaka T, Ishidoshiro A, Tani K, et al. Scanning electron microscope imaging of bacteria based on DNA sequence［J］.Letters in Applied Microbiology, 2009, 49（6）：796-799.

［29］Handelsman J, Rondon MR, Brady SF, et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes：a new frontier for natural products［J］. Chemistry & Biology, 1998, 5（10）：R245-R249.

［30］Leininger S, Urich T, Schloter M, et al. Archaea predominate among ammonia-oxidizing prokaryotes in soils［J］. Nature, 2006, 442（7104）：806-809.

［31］Frias-Lopez J, Shi Y, Tyson GW, et al. Microbial community gene expression in ocean surface waters［J］. Proc Natl Academy of Sciences, 2008, 105（10）：3805-3810.

［32］Kalyuzhnaya MG, Lapidus A, Ivanova N, et al. High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities［J］. Nature Biotechnology, 2008, 26（9）：1029-1034.

［33］Korem T, Zeevi D, Suez J, et al. Growth dynamics of gut microbiota in health and disease inferred from single metagenomic samples［J］. Science, 2015, 349（6252）：1101-1106.

［34］Brown CT, Olm MR, Thomas BC, et al. In situ replication rates for uncultivated bacteria in microbial communities［J］. BioRxiv,2016：057992.

［35］Voorhies AA, Eisenlord SD, Marcus DN, et al. Ecological and genetic interactions between cyanobacteria and viruses in a lowoxygen mat community inferred through metagenomics and metatranscriptomics［J］. Environ Microbiol, 2016, 18（2）：358-371.

［36］De Filippis F, Genovese A, Ferranti P, et al. Metatranscriptomics reveals temperature-driven functional changes in microbiome impacting cheese maturation rate［J］. Scientific Reports, 2016, 6：21871.

［37］Bagchi S, Lamendella R, Strutt S, et al. Metatranscriptomics reveals the molecular mechanism of large granule formation in granular anammox reactor［J］. Scientific Reports, 2016, 6 ：28327.

［38］楊麥云, 陳鵬. 生物正交標(biāo)記反應(yīng)研究進(jìn)展［J］. 化學(xué)學(xué)報,2015, 73（8）：783-792.

［39］Hatzenpichler R, Scheller S, Tavormina PL, et al. In situ visualization of newly synthesized proteins in environmental microbes using amino acid tagging and click chemistry［J］.Environ Microbiol, 2014, 16（8）：2568-2590.

［40］Borneman J. Culture-independent identification of microorganisms that respond to specified stimuli［J］. Appl Environ Microbiol,1999, 65（8）：3398-3400.

［41］Radajewski S, McDonald IR, Murrell JC. Stable-isotope probing of nucleic acids：a window to the function of uncultured microorganisms［J］. Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14（3）：296-302.

［42］Blazewicz SJ, Barnard RL, Daly RA, et al. Evaluating rRNA as an indicator of microbial activity in environmental communities：limitations and uses［J］. The ISME Journal, 2013, 7（11）：2061-2068.

［43］Hoehler TM, Jorgensen BB. Microbial life under extreme energy limitation［J］. Nature Reviews Microbiology, 2013, 11（2）：83-94.

［44］Paerl HW, Steppe TF. Scaling up：the next challenge in Environ Microbiol［J］. Environ Microbiol, 2003, 5（11）：1025-1038.

Research Progress on in situ Detection Methods of Microorganisms

SONG Wei-feng LI Ming-cong GAO Zheng
（School of Life Science，Shandong Agricultural University，State Key Laboratory of Crop Biology，Tai’an 271000）

As major participants in ecosystem material cycle and energy flow，microorganisms play an important role in the ecosystem.However，the proportion of the cultivable microorganism under the existing technology is very small，which limits the exploit of microbial resources. At present，there are a number of approaches that can avoid the problem of uncultured microorganisms，which are designed to study in situ microbial activity. Regarding this，we summarized some research methods of studying in situ microbial ecology，allowing it convenient to reasonably use these methods in the future. This article introduces the corresponding microbial detection methods of BrdU-labeling，DNA-SIP，fluorescence in situ hybridization（FISH），and environmental transcriptome from DNA level，RNA level and protein level，respectively，and compares their advantages and disadvantages. It also introduces how to apply these methods combined with popular high-throughput sequencing and single cell sequencing technology to capture the in situ activity of microbial groups. At the same time，comparing the characteristics of these methods，so that we can more clearly understand the choice of different methods under different scenarios. These modified methods combined with other methods will be conducive to solve many have-been or will-happen problems in the study of microbial ecology. The ecosystems on the earth are complex and huge，in which the microbial populations vary. A variety of in situ detection methods have made a more realistic and effective description for the physiology and ecology of microorganisms，which will become a powerful tool for the study of microorganisms.

microbial detection in sit；BrdU-labeling；DNA-SIP；fluorescence in situ hybridization；metagenome；transcriptome；BONCAT

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0550

2017-07-02

國家自然科學(xué)基金項目（41306150），山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金（BS2012HZ011），河口海岸學(xué)國家重點實驗室開放課題（SKLEC-KF201603）

宋偉鳳，女，研究方向：微生物生態(tài)；E-mail：songweifeng9719@qq.com，李明聰為共同第一作者

高崢，男，博士，副教授，研究方向：微生物生態(tài)與環(huán)境微生物學(xué)；E-mail：gaozheng@sdau.edu.cn

（責(zé)任編輯 狄艷紅）