“柳城05136號(hào)”甘蔗脫毒培養(yǎng)

黃勇，張鐵，劉偉

（云南省文山學(xué)院，云南文山663099）

“柳城05136號(hào)”甘蔗脫毒培養(yǎng)

黃勇，張鐵，劉偉

（云南省文山學(xué)院，云南文山663099）

以“柳城05136號(hào)”甘蔗為材料，通過(guò)預(yù)處理與脫毒培養(yǎng)，旨在建立起“柳城05136號(hào)”甘蔗健康種苗繁育體系。結(jié)果表明：經(jīng)預(yù)處理，莖段腋芽萌發(fā)率達(dá)94%。莖尖在MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+AC 3.0g/L培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。在增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0mg/L+KT 0.5mg/L中增殖系數(shù)達(dá)15.2。在生根培養(yǎng)基MS+NAA 1.0mg/L中，生根率達(dá)95%。經(jīng)煉苗移栽存活率為92%。由此，建立了“柳城05136號(hào)”甘蔗健康種苗繁育體系，豐富了甘蔗健康種苗生物多樣性。

甘蔗；“柳城05136號(hào)”；脫毒培養(yǎng)

甘蔗 （Saccharum officinarumLinn） 為禾本科（Gramineae）甘蔗屬（Saccharum）植物，我國(guó)南方熱帶地區(qū)廣泛種植[1]。由于長(zhǎng)期無(wú)性繁殖，病毒病嚴(yán)重危害，導(dǎo)致甘蔗品種退化、產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣。采用傳統(tǒng)的物理、化學(xué)及生物等方法來(lái)防治病毒病收效甚微。熱處理可鈍化病毒，莖尖培養(yǎng)更是生產(chǎn)無(wú)病毒種苗的有效途徑[2]。將兩者結(jié)合起來(lái)可以除去甘蔗花葉病、宿根矮化病等病害，生產(chǎn)健康種苗[3-8]。巴西、古巴、美國(guó)、澳大利亞等世界甘蔗生產(chǎn)大國(guó)蔗區(qū)均使用健康種苗。如巴西使用甘蔗健康種苗，產(chǎn)量提高20%～40%，含糖量提高0.5%以上[9]。健康種苗對(duì)甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展至關(guān)重要，而我國(guó)在甘蔗生產(chǎn)上只有少數(shù)地區(qū)使用健康種苗，而且品種單一，僅有脫毒“新臺(tái)糖22號(hào)”。有關(guān)“柳城05136號(hào)”健康種苗的研究國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)“柳城05136號(hào)”進(jìn)行預(yù)處理和脫毒培養(yǎng)，希望建立“柳城05136號(hào)”甘蔗健康種苗繁育體系，豐富健康種苗的多樣性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將“柳城05136號(hào)”甘蔗切成帶腋芽的莖段作為試驗(yàn)材料。

1.2 材料預(yù)處理

1.2.1 溫湯浸種

甘蔗莖段放入50℃恒溫水浴鍋中溫湯浸種15min。

1.2.2 恒溫培養(yǎng)

恒溫培養(yǎng)箱中放置育苗盤(pán)，育苗盤(pán)上平鋪一層濕潤(rùn)的毛巾。甘蔗莖段兩端蘸取殺菌劑后橫放在濕毛巾上。腋芽生長(zhǎng)點(diǎn)朝上，如圖1所示。莖段上方再平鋪一層濕毛巾。培養(yǎng)溫度為35℃、相對(duì)濕度為80%、光照強(qiáng)度為1000lx，觀察腋芽萌發(fā)情況。

圖1 甘蔗腋芽培養(yǎng)方式

1.2.3 消毒處理

待甘蔗莖段腋芽萌發(fā)后即揭掉上層濕潤(rùn)毛巾。腋芽長(zhǎng)到2cm左右時(shí)，將腋芽帶少量莖切下進(jìn)行消毒。75%酒精消毒1min后用無(wú)菌水沖洗3次。0.1%HgCl2消毒25 min后用無(wú)菌水沖洗5次。

1.3 脫毒培養(yǎng)

1.3.1 莖尖生長(zhǎng)

剝?nèi)∏o尖接種到以MS為基本培養(yǎng)基、6-BA（0.5、1.0、2.0、4.0mg/L）、2,4-D（0.5、1.0、2.0、4.0mg/L）、AC 3.0g/L、蔗糖（30g/L）、瓊脂（7g/L）的莖尖生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。共16個(gè)處理，每處理接種8瓶，每瓶接種5個(gè)莖尖。培養(yǎng)條件為溫度25℃、光照強(qiáng)度2000lx，觀察莖尖生長(zhǎng)情況。

1.3.2 增殖培養(yǎng)

等到莖尖長(zhǎng)到3cm左右時(shí)，轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA（1.0、2.0、3.0、4.0mg/L），KT （0.1、0.2、0.5、1.0mg/L）， 蔗 糖（30g/L），瓊脂（7g/L）。共16個(gè)處理，每個(gè)處理接種12瓶，每瓶接種3個(gè)外植體。培養(yǎng)條件為溫度28℃、光照強(qiáng)度3000lx。觀察生長(zhǎng)情況。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，并用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[10]。

1.3.3 生根培養(yǎng)

無(wú)根苗轉(zhuǎn)到以 MS為基本培養(yǎng)基、NAA（0.5、1.0、2.0、4.0mg/L）、蔗糖（30g/L）、瓊脂（7g/L）的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。共4個(gè)處理，每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種8棵無(wú)根苗。培養(yǎng)在溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000lx條件下，觀察生根情況。

1.4 煉苗移栽

將甘蔗苗移至室外陰涼處放置1d，擰松瓶蓋放置1d，揭除瓶蓋放置1d。取出甘蔗苗，將附著在根部的培養(yǎng)基洗凈，殺菌劑消毒，種植在溫室中。

初期應(yīng)設(shè)置遮陽(yáng)網(wǎng)，防止暴曬。到中期時(shí)撤除遮陽(yáng)網(wǎng)。加強(qiáng)溫度、水分、營(yíng)養(yǎng)管理，使甘蔗種苗逐步適應(yīng)自然條件。

1.5 病害檢測(cè)

參照李利君等（2000）[11]和 Clyn James（1997）[12]的方法對(duì)“柳城05136號(hào)”甘蔗種苗進(jìn)行花葉病和宿根矮化病的檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 腋芽萌發(fā)

通過(guò)溫湯浸種與恒溫培養(yǎng)，“柳城05136號(hào)”甘蔗腋芽萌發(fā)率為94%，到7d左右時(shí)生長(zhǎng)到2cm左右。如圖2所示。此法打破腋芽休眠，不受季節(jié)限制，可隨時(shí)取材進(jìn)行甘蔗脫毒培養(yǎng)。

圖2 預(yù)處理后腋芽萌發(fā)情況

2.2 莖尖生長(zhǎng)情況

在不同6-BA與2,4-D濃度組合的培養(yǎng)基中，莖尖生長(zhǎng)情況有所不同。其中，在MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+AC 3.0g/L中，莖尖的生長(zhǎng)速度快、畸形苗少，是較適宜的莖尖生長(zhǎng)培養(yǎng)基，如圖3所示。當(dāng)6-BA和2,4-D的濃度過(guò)高時(shí)畸形苗多，且形成大量愈傷組織，莖尖無(wú)法正常生長(zhǎng)；濃度過(guò)低莖尖生長(zhǎng)慢或不生長(zhǎng)。

圖3 在適宜培養(yǎng)基中甘蔗莖尖生長(zhǎng)情況

2.3 增殖系數(shù)

在不同的增殖培養(yǎng)基中，增殖系數(shù)高低不一。對(duì)其進(jìn)行極差分析，結(jié)果如表1所示。

從表 1 可以看出，對(duì)于 6-BA 來(lái)說(shuō)，k2＞k3＞k1＞k4，即當(dāng)6-BA濃度為2.0mg/L時(shí)增殖系數(shù)最高，平均為11.7。對(duì)于 KT來(lái)說(shuō)，k3＞k2=k4＞k1，即當(dāng) KT濃度為 0.5mg/L時(shí)增殖系數(shù)最高，平均為9.6。從極差R來(lái)看，6-BA＞KT，說(shuō)明6-BA對(duì)甘蔗增殖系數(shù)的影響大于KT。處理7最優(yōu)，即“柳城05136號(hào)”甘蔗在增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0mg/L+KT0.5mg/L中增殖系數(shù)最高，達(dá)15.2。

用SPSS軟件對(duì)甘蔗增殖情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出，6-BA和KT對(duì)“柳城05136號(hào)”甘蔗增殖系數(shù)均有極顯著的影響，且二者之間還存在極顯著的交互作用。說(shuō)明適宜濃度的6-BA和KT搭配使用，對(duì)“柳城05136號(hào)”甘蔗的增殖起著至關(guān)重要的作用。

2.4 生根情況

無(wú)根苗在不同的生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況有差異。其中，在MS+NAA1.0mg/L中，生根率最高，達(dá)95%，且根多而長(zhǎng)，如圖4所示。

圖4 甘蔗在適宜培養(yǎng)基中生根情況

2.5 移栽存活率

煉苗移栽后，“柳城05136號(hào)”甘蔗種苗生長(zhǎng)正常，存活率達(dá)92%。

2.6 病害檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)，種苗脫去了花葉病和宿根矮化病，從而繁育出“柳城05136號(hào)”甘蔗健康種苗。由于在培養(yǎng)的植株中許多病毒具有延遲的恢復(fù)期，所以在最初18個(gè)月中每隔一定時(shí)間需進(jìn)行鑒定。而且無(wú)病毒植株容易再被感染，因此在繁殖的不同時(shí)期仍需重復(fù)進(jìn)行鑒定。只有對(duì)待定的病毒顯示持續(xù)陰性反應(yīng)的無(wú)病毒植株才能進(jìn)一步擴(kuò)大繁殖[2]。“柳城05136號(hào)”甘蔗健康種苗在田間是否具有抗花葉病和宿根矮化病特性有待進(jìn)一步的大田試驗(yàn)。

3 討論

世界甘蔗生產(chǎn)大國(guó)在生產(chǎn)上已普遍使用健康種苗，而我國(guó)只有部分地區(qū)使用健康種苗，而且品種比較單一，對(duì)我國(guó)甘蔗產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展不利。本試驗(yàn)通過(guò)材料預(yù)處理與脫毒培養(yǎng)，建立了“柳城05136號(hào)”甘蔗健康種苗的繁育體系，豐富了甘蔗健康種苗的生物多樣性。在生產(chǎn)中是否始終具有花葉病與宿根矮化病抗性，是否能發(fā)揮甘蔗健康種苗高產(chǎn)、高糖的“雙高”優(yōu)勢(shì)，有待進(jìn)一步的大田試驗(yàn)。

表1 “柳城05136號(hào)”甘蔗增殖系數(shù)極差分析表

表2 “柳城05136號(hào)”甘蔗增殖系數(shù)方差分析表因變量：增殖系數(shù)

[1]吳征鎰.中國(guó)植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1997,10(2):41.

[2]彭星元,余皖蘇.植物組織培養(yǎng)技術(shù)（第二版）[M].北京:高等教育出版社,2013,1:85-94.

[3]Leu LS.Freeing sugarcane from mosaic virus by apical meristem culture and tissue culture[R].Report Taiwan Sugar Experiment Station,1972,57:57-63.

[4]Hendre RA,Mascarenhas AF,Nadgir AL,et al.Growth ofmosaic virus-free sugarcane plants from apical meristems[R].Indian Pathology,1975,28:185-198.

[5]Waterworth R,Kahn RP.Thermotherapy and aseptic bud culture of sugarcane to facilitate the exchange of germplasm and passage through quarantine[R].Plant Disease Report,1978,62:772-776

[6]Leu LS.Apical meristem culture and redifferentiation of callus masses to free some sugarcane systemic disease[J].Plant Protection Bulletin,1978,20:77-82

[7]楊本鵬,張樹(shù)珍,楊學(xué),等.甘蔗健康種苗培育體系的建立[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2006,(4):74-77.

[8]游建華,樊保寧,韋昌聯(lián).甘蔗脫毒健康種苗生產(chǎn)及繁殖技術(shù)[J].中國(guó)種業(yè),2008(9):50.

[9]Lee TSG.Micropropagation of sugarcane (Saccharum spp.)[J].Plant cell,tissue and organ culture,1991,10:47-55.

[10]方開(kāi)泰,馬長(zhǎng)興.正交與均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì) [M].北京:科學(xué)出版社,2001:35-52.

[11]李利君,周仲駒,謝聯(lián)輝.利用斑點(diǎn)雜交法和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)甘蔗花葉病毒[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,29(3):342-345.

[12]Clyn James.A reviewof ratoon stunting disease[J].Sugar Cane,1997,4:9-14.

Virus-free Culture of Sugarcane"Liucheng No.05136"

HUANG Yong,ZHANG Tie,LIU Wei
(Wenshan University of Yunnan Province,Wenshan 663099,China)

It aimd at building a breeding system of healthy seedling of sugarcane of"Liucheng No.05136"by pretreating and virus-free culture.The result showed that germination rate of lateral bud was 94%after pretreating.Stem tip growed well in the medium of MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+AC 3.0mg/L.Multiplication rate was 15.2 in the subculture medium of MS+6-BA 2.0mg/L+KT 0.5mg/L.Rooting rate was high to 95%in the rooting medium of MS+NAA 1.0mg/L.Survival rate was 92%after acclimatizing and transplanting.A breeding system of healthy seedling for"Liucheng No.05136"was built up.Biodiversity of healthy seedling of sugarcane was enriched.

Sugarcane;"Liucheng No.05136";virus-free culture

S566.1

A

1008-1038(2017)10-0070-04

10.19590/j.cnki.1008-1038.2017.10.021

2017-08-02

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2012Y269）；文山學(xué)院科學(xué)研究基金項(xiàng)目（13WSY06）；文山州科技計(jì)劃項(xiàng)目

黃勇（1981—），男，講師，主要從事植物資源開(kāi)發(fā)工作