新型固相微萃取涂層材料的制備及其在迷迭香揮發性成分檢測分析中的應用

何 靜，李 濤，董美玉，董 南

(貴州大學 化學與化工學院，貴州 貴陽 550025)

新型固相微萃取涂層材料的制備及其在迷迭香揮發性成分檢測分析中的應用

何 靜，李 濤，董美玉，董 南*

(貴州大學 化學與化工學院，貴州 貴陽 550025)

利用溶膠-凝膠法制備了含全羥基取代五元瓜環(Q[5])的新型固相微萃取涂層。以全羥基取代五元瓜環(Q[5](OH)10)和端羥基聚二甲基硅氧烷(OH-PDMS)為起始原料，γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH-560)為偶聯試劑，通過水解和縮合反應制備了 PDMS/Q[5](OH)10新型涂層。采用掃描電鏡、傅立葉紅外光譜、差示掃描量熱分析和熱重分析分別對涂層組織形貌、結構特點以及熱穩定性進行了檢測。結果表明該涂層具有較大的表面積，良好的熱穩定性(360 ℃)和較長的使用壽命。將該涂層制備成固相微萃取纖維，聯用氣相色譜-質譜技術對迷迭香的揮發性成分進行了分析，并用面積歸一法測定其相對含量。優化的萃取條件為：萃取溫度80 ℃，萃取時間45 min,樣品質量0.200 0 g。在此條件下，鑒定出迷迭香中的25種揮發性成分，含量較高的成分為1,8-桉葉素、樟腦和α-蒎烯。將自制纖維與商用纖維(PDMS/DVB/CAR)的萃取效果進行了對比，從萃取成分的數量和含量來看，自制纖維的萃取效果和商用纖維相當，說明自制的固相微萃取纖維可用于植物中揮發性成分的快速檢測分析。

溶膠-凝膠技術；固相微萃取涂層；全羥基取代五元瓜環；氣相色譜-質譜；迷迭香

迷迭香為唇形科植物迷迭香RosmarinusofficinalisL.(ROL)的全草，原產南歐各國。迷迭香揮發油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、霍亂弧菌等有抗菌作用，效力中等[1]。 迷迭香揮發油的提取一般采用水蒸氣蒸餾結合溶劑萃取法[2]、超臨界CO2萃取法[3]等,分析檢測主要采用氣相色譜-質譜聯用技術[4-5]。采用傳統方法提取時，樣品用量多，操作復雜，過程損失較大，且需使用有機溶劑。

固相微萃取(SPME)技術是一種新穎的樣品前處理技術。該技術由加拿大Waterloo大學的Pawliszyn教授于1989年最先提出[6]，美國Supelco公司于1993年將其商品化。SPME集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，具有簡便、快速、便攜、高效、無需有機溶劑及易與氣相色譜、高效液相色譜、氣相色譜-質譜聯用、毛細管電泳等分析儀器聯用的優點。因此，在環境分析[7-8]、食品分析[9]、藥物分析[10-11]、生物樣品分析[12]等領域得到了廣泛的應用。SPME目前已商品化的涂層有聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯和聚二甲基硅氧烷/羧乙基等。商品涂層是將吸附材料直接涂覆在石英纖維載體上，其穩定性和選擇性較差，推薦使用溫度普遍偏低(200～280 ℃)，使用壽命短(一般約為40～100次)，價格昂貴，因而大大限制了其應用。隨著分析樣品的增多，尤其是對復雜基體中樣品檢測需求的擴大，開發高選擇性、高效的固相涂層材料成為SPME研究的重要方向。

瓜環是一類由亞甲基橋聯苷脲單元形成的新型大環化合物，從結構來看，其內部疏水性的空腔結構可通過疏水作用與小分子發生包結作用，同時其空腔兩端口環繞的多個羰基可通過離子-偶極、氫鍵作用與極性分子發生主客體相互作用[13-14]，因此瓜環是一類分子識別能力較強的大環主體化合物。本文利用瓜環的分子識別能力，將普通五元瓜環(Q[5])衍生化為全羥基取代五元瓜環(Q[5](OH)10)后，以γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH-560)為偶聯劑，通過溶膠-凝膠方法和自由基交聯技術，將瓜環化學鍵合在溶膠-凝膠涂層上，制備出含五元瓜環的新型固相微萃取涂層。將此涂層制備成固相微萃取纖維，并結合氣相色譜-質譜技術對中藥迷迭香的揮發性組分進行分析，取得了滿意的結果。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

迷迭香干葉2015年購于貴陽市宏盛藥店，經貴州省中醫大學陳德媛研究員鑒定為迷迭香；迷迭香干葉經粉碎過100目篩備用。三氟乙酸(TFA)、γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH-560)、正硅酸乙酯(TEOS)、端羥基聚二甲基硅氧烷(OH-PDMS)、含氫硅油(PMHS)均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。固相微萃取裝置：SPME手柄及50/30 μm PDMS/DVB/CAR StableFlex 萃取頭購自美國Supelco 公司。HP4890D氣相色譜儀、HP6890/5974C氣相色譜-質譜聯用儀(美國安捷倫公司)；X-650 掃描電鏡(日本Hitachi公司)；VERTEX70 傅立葉紅外光譜儀(德國Bruker公司)；Netzsch Sta 449C 熱分析儀(德國Netzsch 公司)。

1.2 溶膠-凝膠涂層(PDMS/Q[5](OH)10)的制備

取10 mL聚氯乙烯離心管依次加入全羥基取代五元瓜環(Q[5](OH)1020 mg，二氯甲烷(CH2Cl2)700 μL，端羥基聚二甲基硅氧烷(OH-PDMS)150 μL，含氫硅油(PMHS)30 μL，正硅酸乙酯(TEOS)250 μL，γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH-560)250 μL，振蕩混勻，再加入95%的三氟乙酸(TFA) 600 μL振蕩3 min，并以12 000 r·min-1離心5 min，取上層清液作為溶膠-凝膠涂層。

1.3 自制固相微萃取纖維的制備

取一根長10 cm直徑20 μm的石英纖維，其中1 cm作粘附溶膠凝膠涂層用。將其用丙酮浸泡3 h干燥，再置于1 mol·L-1的NaOH溶液1 h，用蒸餾水洗凈，然后放入0.1 mol·L-1HCl溶液30 min以中和表面殘留的NaOH，最后用蒸餾水洗凈并在氮氣保護下干燥備用。將處理好的石英纖維放入制備好的溶膠-凝膠涂層溶液中30 min后，垂直提拉，通過沾取次數來控制涂層厚度。將涂漬好的石英纖維置于室溫下24 h，涂層厚度約46 μm，比表面積為0.371 1 m2/g。

自制SPME裝置的制備：將5 μL微量進樣器針外套取下,前端截去2 cm,與1 μL 微量進樣器內芯組裝。并將有涂層的石英纖維粘到內芯中固定，之后放在GC進樣口中，在較小的氮氣流下，先保持溫度為120 ℃，干燥60 min，再升溫到280 ℃，繼續干燥60 min，最后升至320 ℃，處理30 min。

1.4 SPME 萃取步驟

稱取0.200 0 g迷迭香于10 mL螺口玻璃樣品瓶中，聚四氟乙烯隔墊密封，80 ℃萃取，插入SPME頂空取樣60 min,將萃取頭插入GC-MS進樣口，于260 ℃解吸2 min 后進樣分析，經NIST 和Wiley 譜庫檢索，結合人工譜圖解析，確定迷迭香的揮發性成分。

1.5 氣相色譜條件

SE-54石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫：初溫50 ℃，保持6 min，以6 ℃·min-1升至160 ℃，再以10 ℃·min-1升至240 ℃。進樣口溫度260 ℃，檢測器溫度280 ℃，載氣：氮氣(99.999%)，不分流進樣，流速：1.0 mL·min-1，檢測器：氫火焰離子檢測器。

1.6 氣相色譜質譜條件

HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱，柱流量1.0 mL·min-1；柱溫：初溫50 ℃，保持4 min，以4 ℃·min-1升至180 ℃，再以8 ℃·min-1升至250 ℃，保持5 min。載氣：高純氦氣；進樣口溫度260 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，離子化能量70 eV，掃描范圍29～300 amu。

2 結果與討論

2.1 涂層的可能結構

以Q[5](OH)10和OH-PDMS 為涂層的固定相，利用OH基團的縮合反應，將溶膠-凝膠形成的三維立體網狀涂層化學鍵合在石英纖維載體上，其形成過程與曾照睿等的報道類似[15]，可能結構如圖1。

圖1 涂層的可能結構 Fig.1 The possible structure of coating

2.2 涂層的表面形態

圖2 是涂層的電鏡掃描圖。從圖2A、2B中可以看出自制溶膠-凝膠涂層的表面致密、均勻、無裂痕，其厚度為44～50 μm，平均厚度為46 μm。圖2B顯示自制涂層表面呈疏松的孔狀結構，圖2C、2D是單獨孔洞的放大圖，表面孔徑多為1～4 μm左右。涂層的多孔性增加了涂層的表面積，有利于提高涂層表面的負載能力，增加涂層對樣品的萃取吸附能力，提高萃取效率。

圖2 各種放大倍數下自制涂層的掃描電鏡照片Fig.2 Scanning electron micrographs of homemade coating with variable magnifications A：×22；B：×500；C：×5 000；D：×3 000

圖3 空白溶膠-凝膠PDMS(a)、Q[5](OH)10(b)與PDMS/Q[5](OH)10(c)涂層的紅外譜圖Fig.3 FTIR spectra of blank sol-gel PDMS(a)，Q[5](OH)10(b) and PDMS/Q[5](OH)10(c)coatings

圖4 PDMS/Q[5](OH)10涂層在氮氣氛圍下的TG和DSC曲線圖Fig.4 TG and DSC curve of PDMS/Q[5](OH)10 coating in nitrogen gas atmosphere heating rate:10 ℃·min-1

2.3 涂層的結構

2.4 涂層的熱穩定性

圖4是涂層的差示掃描量熱(DSC)和熱重(TG)分析圖。從圖中可看出，PDMS/Q[5](OH)10涂層在氮氣氣氛下，66.2 ℃時開始失去瓜環結合的結晶水，其質量減少2.42%。在失去水后，加熱直至360 ℃其質量均不會發生改變。升溫至600 ℃失重也僅為8.93%，這說明利用溶膠凝膠法制備的PDMS/Q[5](OH)10涂層，熱穩定性好，其最高使用溫度可達360 ℃左右，優于商品化涂層的最高溫度(300 ℃左右)，同時也滿足氣相色譜熱解析的溫度(250～300 ℃)，方便與氣相色譜儀聯用。涂層良好的熱穩定性可能是源于涂層與石英纖維之間的化學鍵合作用[17]，并且可以拓寬分析物質的范圍，有利于分析沸點更高的化合物。

2.5 涂層的使用壽命

將涂層制備成固相微萃取纖維，以迷迭香中的主要成分1,8-桉葉素和α-蒎烯的峰面積之和為指標，用該自制萃取頭連續萃取90次，計算峰面積變化的相對標準偏差(RSD)為6.4%，表明自制萃取頭重復性好，使用壽命長，同時也表明使用化學鍵合方式制備涂層可使萃取頭具有較長的使用壽命，能較好地克服商品涂層因涂覆方式使用壽命較短的缺陷。

2.6 萃取條件的優化

以迷迭香中的4種主要成分1,8-桉葉素、樟腦、龍腦和β-石竹烯的峰面積為考察對象，探討不同萃取條件對萃取峰面積的影響以得到最優的萃取條件。

2.6.1萃取溫度采用自制PDMS/Q[5](OH)10萃取頭，分別在20、40、60、80、90 ℃條件下對迷迭香揮發性組分進行頂空萃取，經GC 分析獲得4種組分的峰面積。結果顯示，在溫度低于40 ℃時，4種組分的峰面積變化不大，40 ℃后繼續升高溫度，峰面積不斷增大，80 ℃后趨于平衡，因此選擇80 ℃作為最優的萃取溫度。

2.6.2萃取時間的優化考察不同萃取時間(5、15、30、45、90 min)下4種組分峰面積的變化。結果發現，隨著萃取時間的增長，揮發性組分的峰面積逐步增大，直到45 min后達到萃取平衡，因此選擇45 min為最佳萃取時間。

2.6.3萃取樣品質量的優化分別稱取0.050 0、0.100 0、0.200 0、0.300 0、0.500 0 g迷迭香樣品，用自制萃取頭進行頂空萃取，經GC 分析得到不同樣品質量下揮發性組分的峰面積。結果表明，樣品質量在0.200 0 g后，揮發性組分的峰面積趨于平衡，因此選擇樣品量為0.200 0 g。

圖5 迷迭香揮發油的GC-MS總離子圖Fig.5 Total ion GC-MS chromatogram of essential oil in ROL

2.7 迷迭香揮發性成分的分析

在上述最佳萃取條件下，用46 μm自制的PDMS/Q[5](OH)10萃取頭對迷迭香的揮發性組分及其相對含量進行了測定。共鑒定出25種迷迭香成分，占揮發性成分的90.5%(見表1和圖5)。含量最高的是1,8-桉葉素、樟腦和α-蒎烯，與文獻報道值相符[1-2,4]。其中迷迭香揮發油中的活性成分如蒎烯、莰烯、水芹烯、α-水芹烯、1,8-桉葉素、樟腦、龍腦、乙酸龍腦酯、α-石竹烯等均被萃取并鑒定。為驗證自制萃取纖維的萃取效果，以萃取揮發油最常用的商用纖維(PDMS/DVB/CAR)對相同樣品進行了頂空固相微萃取并經GC-MS 分析(表1)。從表1中可看出，自制纖維萃取出25種成分，商用纖維萃取出24種，兩者共有的成分為20種，并且相對含量相近。對于文獻報道中迷迭香揮發油中的優勢成分或活性成分，如1,8-桉葉素、樟腦、α-蒎烯、崁烯、龍腦、α-石竹烯、β-石竹烯、α-水芹烯等成分，兩種纖維均能萃取出來并且含量相近，說明自制的固相微萃取纖維能有效地萃取植物中的揮發性成分。

表1 迷迭香的揮發性成分及相對含量Table 1 Chemical components in ROL essential oil

(續表1)

No.CompoundMolecularformulaRelativepercentcontent%(mean±RSD%)(n=3)50/30μmPDMS/DVB/CAR46μmPDMS/Q[5](OH)10112,4-Dimethylstyrene(2,4-二甲基苯乙烯)C10H12-0.126±6.512α-Terpinolene(α-松油烯)C10H16-0.523±6.913Linalool(芳樟醇)C10H18O0.866±4.9-14Camphor(樟腦)C10H16O9.340±3.86.654±3.615Borneol(龍腦)C10H18O2.660±4.41.345±5.316Terpinene-4-ol(4-萜烯醇)C10H18O0.520±5.80.512±4.817α-Terpineol(α-松油醇)C10H18O2.560±6.10.949±6.518Bornylacetate(乙酸龍腦酯)C10H20O20.662±7.30.594±6.819Ylangene(衣蘭烯)C15H240.128±5.8-20Copaene(古巴烯)C15H240.088±8.50.221±8.121cis-Caryophyllene(cis-石竹烯)C15H24-0.153±5.922Methyleugenol(甲基丁香酚)C11H14O20.170±6.9-23β-Caryophyllene(β-石竹烯)C15H2412.45±3.73.282±4.924α-Caryophyllene(α-石竹烯)C15H240.476±5.50.503±5.825β-Bisabolene(β-紅沒藥烯)C15H240.397±6.30.133±6.126d-Cadinene(d-杜松烯)C15H240.149±5.3-27Caryophylleneoxide(石竹烯氧化物)C15H24O0.338±6.70.088±8.228Hexadecanoic(棕櫚酸)C16H32O2-1.578±4.829Oleicacid(油酸)C18H34O24.851±4.110.64±4.2

*no detected

3 結 論

采用溶膠-凝膠技術制備了含全取代羥基五元瓜環的新型固相微萃取涂層。該涂層具有表面積大、熱穩定性好、使用壽命長的優點，方便與各類分析儀器聯用。利用該新型溶膠-凝膠涂層制備的萃取纖維能有效地萃取迷迭香中的揮發性成分，萃取效果與商用纖維相當，但該自制纖維比商用纖維熱穩定性更好。同時，該纖維因為鍵合制備的方式，涂層不易脫落，比商用纖維更適用于不同的萃取模式(如浸入式萃取)。該自制纖維的制備可為開發高選擇性和高效的SPME提供一種新的材料種類和研究思路。

[1] Zhou X.GuizhouSci.(周欣.貴州科學),2002,20(1):78-80.

[2] Gu K,Cheng W X,Li Y C,Li C.J.YunnanUniv.(古昆，程偉賢，李云川，李聰.云南大學學報),2003,25(3):258-260.

[3] Zhang Y H,Wang L.Chin.Pharm.(張玉紅,王磊.中國藥房),2010,21(47):4441-4443.

[4] Chen Z F,Yang J L,Wang C D,Cui S Y.ChineseTraditionalandHerbalDrugs(陳振峰，楊建莉，王春德，崔樹玉.中草藥),2001,32(12):1085-1086.

[5] Su X Y,Zhang B.IndustryofChina(蘇曉雨，張寶.中國產業),2012,9:22.

[6] Arthur C L,Pawliszyn J.Anal.Chem.,1990,62:2145-2148.

[7] Yu H L,Merbi J,Anderson J L.J.Chromatogr.A,2016,1438:10-21.

[8] Meng J,Wang G,Han M,Zhai Z X,Geng J,Lu F L.J.Instrum.Anal.(孟潔，王亙，韓萌，翟增秀，耿靜，魯富蕾.分析測試學報)，2016，35(12):1611-1615.

[9] Shamsipur M,Yazdanfar N,Ghambarian M.FoodChem.,2016,204:289-297.

[10] Mirzajani R,Kardani F.J.Pharm.Biomed.Anal.,2016,122:98-109.

[11] Wu H Q,Hou S R,Huang X L,Lin X S,Zhu Z X,Huang F,Ma Y F.J.Instrum.Anal.(吳惠勤，侯思潤，黃曉蘭，林曉珊，朱志鑫，黃芳，馬葉芬.分析測試學報)，2016，35(11):1369-1375.

[12] Terzopoulou Z,Papageorgiou M,Kyzas G Z,Bikiaris D N,Lambropoulou D A.Anal.Chim.Acta,2016,913:63-75.

[13] Freeman W A,Mock W L,Shin N Y.J.Am.Chem.Soc.,1981,103(24):7367-7368.

[14] Lee J W,Samal S,Selvapalam N,Kim H J,Kim K.ACC.Chem.Res.,2003,36(8):621-630.

[15] Zeng Z R,Qiu W L,Huang Z F.Anal.Chem.,2001,73(11):2429-2436.

[16] Shu J J,Xie P F,Lin D N,Chen R F,Wang J,Zhang B B,Liu M M,Liu H L,Liu F.Anal.Chim.Acta,2014,806:152-164.

[17] Chong S L,Wang D,Hayes J D,Wilhite B W,Mailk A.Anal.Chem.,1997,69(19):3889-3898.

Preparation of a Novel Solid-phase Microextraction Coating and Its Application in Determination of Volatile Components inRosmarinusofficinalisL.

HE Jing,LI Tao,DONG Mei-yu,DONG Nan*

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

A novel solid phase microextraction coating that contains perhydroxy cucurbit[5]uril was prepared by a sol-gel method.With 3-(2-cyclooxypropoxyl) propyltrimethoxysilane as cross-linking agent,Perhydroxyl cucurbit[5]uril(Q[5](OH)10) and hydroxy-terminated poly(dimethylsiloxane)(OH-PDMS) were used as starting coating material to bond chemically to a fused-silica substrate to form a PDMS/Q[5](OH)10coating by hydrolysis and polycondensation reactions.The surface morphology,microstructure and thermal stability of the obtained composite coating were characterized by scanning electron microscopy(SEM),Fourier-transform infrared spectrometry(FTIR),differential scanning calorimetry(DSC) and thermogravimetric(TG) analysis.The results showed that the coating has a large specific surface area,high thermal stability(360 ℃) and long lifetime.Its performance was tested using a homemade solid-phase microextraction coating fiber coupled with gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) to analyze volatile components inRosmarinusofficinalisL(ROL).The optimized solid-phase microextraction conditions included an extraction temperature of 80 ℃,an extraction time of 45 min and a 0.200 0 g sample.The volatile components were extracted by head solid-phase microextraction(HS-SPME) with a homemade extraction fiber,and identified by GC-MS.The relative content of each component was determined by area normalization.Twenty-five compounds in the ROL were identified.The main compounds are 1,8-cineole,camphor andα-pinene.The homemade fiber was compared with commercial fiber(PDMS/DVB/CAR).According to the quantity and content of the extracts from ROL,the extraction effect of the two kinds of fiber are equivalent,which indicated that the homemade novel fiber could be applied in the rapid detection of volatile components in plants.

sol-gel technology;solid-phase microextraction coating;perhydroxy cucurbit[5]uril;gas chromatography-mass spectrometry;RosmarinusofficinalisL.(ROL)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.10.003

O657.7;O657.63

A

1004-4957(2017)10-1185-06

2017-05-18；

2017-06-19

國家自然科學基金項目(81160398,21665005)

*

董 南，博士，教授，研究方向：分析化學，Tel:0851-83621679，E-mail:ndong@gzu.edu.cn