木質(zhì)纖維生物質(zhì)對(duì)纖維素酶的可及性測(cè)定方法研究進(jìn)展

吳琳梅，丁 銳，薛紹禮，夏覓真

(安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230032)

木質(zhì)纖維生物質(zhì)對(duì)纖維素酶的可及性測(cè)定方法研究進(jìn)展

吳琳梅，丁 銳，薛紹禮，夏覓真*

(安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230032)

木質(zhì)纖維生物質(zhì)通過(guò)酶解轉(zhuǎn)化成乙醇燃料和化工產(chǎn)品具有廣闊的應(yīng)用前景，但木質(zhì)纖維生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組成復(fù)雜，阻礙了其活性位點(diǎn)與纖維素酶的結(jié)合，不利于酶解的進(jìn)行。對(duì)木質(zhì)纖維生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，可以改善其結(jié)構(gòu)，提高其對(duì)纖維素酶的可及性，從而提高酶解效率。重點(diǎn)概述了西蒙染色法、溶質(zhì)排阻法、蛋白質(zhì)吸附法等可及性測(cè)定方法,分析比較了各方法的優(yōu)缺點(diǎn),并對(duì)可及性測(cè)定方法的研究方向進(jìn)行了展望。

木質(zhì)纖維生物質(zhì)；纖維素酶；可及性；酶解；預(yù)處理

木質(zhì)纖維生物質(zhì)占地球植物生物質(zhì)的90%以上，是豐富的可再生資源。利用纖維素酶將木質(zhì)纖維生物質(zhì)降解成可發(fā)酵單糖，然后發(fā)酵生產(chǎn)液體燃料及化工產(chǎn)品，對(duì)于解決能源危機(jī)、環(huán)境污染等難題有著非常重要的意義[1-2]。但是，酶解效率低限制了木質(zhì)纖維生物質(zhì)的有效利用，而木質(zhì)纖維生物質(zhì)對(duì)纖維素酶的可及性低是造成酶解效率低的重要原因[3-4]。可及性是指單位量的木質(zhì)纖維生物質(zhì)中可以與纖維素酶結(jié)合且能夠被酶降解或微生物利用的結(jié)合位點(diǎn)量。一般而言，只有當(dāng)木質(zhì)纖維生物質(zhì)表面位點(diǎn)與纖維素酶接觸、吸附結(jié)合后，才有可能進(jìn)一步被酶降解成可發(fā)酵單糖，因此，可及性是基于酶解的生物處理中最根本的限制因素[3]。然而，木質(zhì)纖維生物質(zhì)細(xì)胞壁微觀結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、主要組分(木質(zhì)素、半纖維素及纖維素)分布的不均一性以及纖維素的超分子結(jié)構(gòu)形成了天然的抗降解屏障，阻礙了纖維素酶與木質(zhì)纖維生物質(zhì)的結(jié)合，不利于酶解，因此，木質(zhì)纖維生物質(zhì)在酶解前要進(jìn)行預(yù)處理，破壞生物質(zhì)細(xì)胞壁抗降解屏障[5]。

目前，關(guān)于木質(zhì)纖維生物質(zhì)預(yù)處理的研究報(bào)道較多[6-7]。雖然預(yù)處理的方法和手段不盡相同，但主要目的一致，即除去木質(zhì)纖維生物質(zhì)中的木質(zhì)素與半纖維素、降低纖維素的結(jié)晶度和聚合度、增大纖維素的表面積和孔隙率等，使得木質(zhì)纖維生物質(zhì)具有適宜的結(jié)構(gòu)特征，提高其對(duì)纖維素酶的可及性，從而提高酶解效率。可及性作為評(píng)價(jià)木質(zhì)纖維生物質(zhì)預(yù)處理效果的重要依據(jù)，為不同木質(zhì)纖維生物質(zhì)的預(yù)處理方法選擇提供了理論指導(dǎo)。但采用不同方法測(cè)定的可及性有所差異，而國(guó)內(nèi)外至今還沒(méi)有統(tǒng)一的可及性測(cè)定方法和標(biāo)準(zhǔn)。鑒于此，作者從原理、應(yīng)用等方面對(duì)可及性測(cè)定方法進(jìn)行簡(jiǎn)述，以期為木質(zhì)纖維生物質(zhì)對(duì)纖維素酶可及性測(cè)定方法的深入研究提供參考。

1 間接法測(cè)定可及性

間接測(cè)定法與木質(zhì)纖維生物質(zhì)的孔道結(jié)構(gòu)(孔徑、孔隙率、孔形貌)和內(nèi)表面積有關(guān)。植物細(xì)胞壁孔徑太小(5～10 nm)，阻礙酶擴(kuò)散，孔徑應(yīng)當(dāng)至少在50～100 nm范圍內(nèi)酶才能夠充分地?cái)U(kuò)散[8]。孔道結(jié)構(gòu)的測(cè)定方法能夠作為可及性的間接評(píng)價(jià)方法，其中，常用的保水值法和BET法因水和氮?dú)夥肿拥闹睆竭h(yuǎn)小于纖維素酶，誤差較大；而西蒙染色法(Simons′ stain)和溶質(zhì)排阻法(solute exclusion)在一定程度上彌補(bǔ)了上述缺陷。

1.1 西蒙染色法

西蒙染色法是一種簡(jiǎn)單易行的可及性半定量測(cè)定方法，主要通過(guò)直接藍(lán)1(direct blue 1 dye，CI constitution No.24410)和直接橙15(direct orange 15 dye，CI constitution No.40002/3)這2種染料在木質(zhì)纖維生物質(zhì)上的競(jìng)爭(zhēng)吸附來(lái)評(píng)價(jià)木質(zhì)纖維生物質(zhì)對(duì)纖維素酶的可及性[9]。直接藍(lán)1分子尺寸小(直徑約1 nm)、對(duì)纖維素的親和力弱，而直接橙15分子尺寸大(直徑5～36 nm)、對(duì)纖維素有很強(qiáng)的親和力[9]。當(dāng)這2種染料分子共同作用于纖維素時(shí)，親和力強(qiáng)的直接橙15大分子優(yōu)先吸附在大孔中，并將大孔中已吸附的直接藍(lán)1替換出來(lái)，致使直接藍(lán)1只能吸附在纖維素的小孔中。因此，直接藍(lán)1與直接橙15的吸附量能指示纖維素結(jié)構(gòu)中大孔與小孔的量。同時(shí)，由于直接橙15的分子尺寸與內(nèi)切葡聚糖酶的催化中心大小相似，所以其吸附量也常用作木質(zhì)纖維生物質(zhì)對(duì)纖維素酶可及性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

A455=εO/455LcO+εB/455LcB

(1)

A624=εO/624LcO+εB/624LcB

(2)

(3)

式中：A455、A624分別為溶液在455 nm、624 nm處的吸光度；εO/455、εO/624分別為直接橙15在455 nm、624 nm下的消光系數(shù)；εB/455、εB/624分別為直接藍(lán)1在455 nm、624 nm下的消光系數(shù)；L為比色皿內(nèi)徑；cO為直接橙15的濃度；cB為直接藍(lán)1的濃度；q為吸附量；Kads為吸附平衡常數(shù)。

Chandra等[10-11]研究蒸汽處理、乙醇-有機(jī)溶劑處理、熱處理等預(yù)處理方法對(duì)木質(zhì)纖維生物質(zhì)酶解效率及染料吸附量的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙醇-有機(jī)溶劑處理時(shí)的酶解效率最高、染料吸附量最大。因此，可以用B+O值表征可及性，B+O值增大時(shí)，可及性提高。此外，Arantes等[12]研究發(fā)現(xiàn)，可及性提高時(shí)O/B值也隨之增大，水解底物所需酶量相應(yīng)減少。

Meng等[13]通過(guò)西蒙染色法比較了稀酸處理和蒸汽爆破處理前后楊屬生物質(zhì)的孔道結(jié)構(gòu)變化，從而研究預(yù)處理對(duì)可及性的影響。結(jié)果表明，楊屬生物質(zhì)未處理前B+O值為67.0 mg·g-1、O/B值為0.19；蒸汽爆破10 min后，B+O值為80.7 mg·g-1、O/B值為0.25；稀酸處理10 min后，B+O值為100.1 mg·g-1、O/B值為0.39。相對(duì)于蒸汽爆破，稀酸處理的B+O值與O/B值均較高，說(shuō)明稀酸處理能有效提高楊屬生物質(zhì)對(duì)纖維素酶的可及性。

1.2 溶質(zhì)排阻法

溶質(zhì)排阻法：木質(zhì)纖維生物質(zhì)在不同尺寸的探針?lè)肿尤芤褐邪l(fā)生溶脹，部分水分子和溶質(zhì)探針?lè)肿舆M(jìn)入孔道結(jié)構(gòu)中，導(dǎo)致溶質(zhì)濃度發(fā)生改變，通過(guò)測(cè)定孔體積或內(nèi)表面積來(lái)評(píng)價(jià)木質(zhì)纖維生物質(zhì)對(duì)纖維素酶的可及性。探針?lè)肿颖仨殱M足以下條件：不與木質(zhì)纖維生物質(zhì)發(fā)生相互作用、非電解質(zhì)、分子量分布窄、在溶液中呈球形等[14]。葡聚糖(dextran)與聚乙二醇(PEG)為常用的探針?lè)肿樱淦骄肿恿考胺肿又睆揭?jiàn)表 1。

表1探針?lè)肿拥钠骄肿恿颗c分子直徑

Tab.1Average molecular weight and molecular

西蒙染色法與溶質(zhì)排阻法均是基于對(duì)木質(zhì)纖維生物質(zhì)的孔道結(jié)構(gòu)表征來(lái)評(píng)價(jià)可及性。區(qū)別在于：西蒙染色法是基于預(yù)處理前后孔數(shù)量變化(B+O值作為依據(jù))及大孔與小孔所占比例的變化(O/B值作為依據(jù))來(lái)評(píng)價(jià)可及性；而溶質(zhì)排阻法是基于孔體積及內(nèi)表面積的變化來(lái)評(píng)價(jià)可及性。木質(zhì)纖維生物質(zhì)具有外表面積與內(nèi)表面積，外表面積主要與木質(zhì)纖維生物質(zhì)的顆粒大小有關(guān)，內(nèi)表面積與孔壁面積有關(guān)。研究表明，90%的酶解效率由底物中酶可及的內(nèi)表面積(孔壁面積)貢獻(xiàn)[15]。因此，木質(zhì)纖維生物質(zhì)的內(nèi)表面積是評(píng)價(jià)可及性的另一重要指標(biāo)。

目前，溶質(zhì)排阻法沒(méi)有統(tǒng)一的操作標(biāo)準(zhǔn)，但測(cè)定流程相似：將一定量的木質(zhì)纖維生物質(zhì)置于一定尺寸的探針?lè)肿尤芤?葡聚糖或聚乙二醇溶液)中進(jìn)行膨脹處理，靜置一段時(shí)間后取上清液，離心，用HPLC法測(cè)定上清液中溶質(zhì)的濃度。溶質(zhì)排阻法的關(guān)鍵是利用溶質(zhì)濃度的變化計(jì)算孔體積及內(nèi)表面積。溶質(zhì)濃度的變化滿足質(zhì)量守恒定律[16]：

(4)

式中：δi為以分子直徑為i的探針?lè)肿訛槿苜|(zhì)時(shí)單位木質(zhì)纖維生物質(zhì)孔道中可及水分子的質(zhì)量，g·g-1；w為溶質(zhì)溶液的初始質(zhì)量，g；q為木質(zhì)纖維生物質(zhì)所含水的質(zhì)量，g；P為木質(zhì)纖維生物質(zhì)的干量，g；c0與c分別為溶質(zhì)初始濃度與離心后上清液中溶質(zhì)的濃度，%。

水的密度以1 g·mL-1計(jì)，則δi=Vi(水分子所占據(jù)的孔道體積)。因此，分子直徑為i的溶質(zhì)分子所占據(jù)的孔道體積Va=Vall-Vi(式中Vall為孔道總體積)。若以聚乙二醇為探針?lè)肿樱瑒tVall等于以平均分子量在3 350～10 000之間的聚乙二醇探針?lè)肿铀?jì)算出的Vi平均值[17]；若以葡聚糖為探針?lè)肿樱琕all等于以分子直徑為560 ?的葡聚糖分子dextran T2000所計(jì)算出的Vi值。因?yàn)椋琩extran T2000探針?lè)肿拥某叽缱畲?560 ?)，很難進(jìn)入木質(zhì)纖維生物質(zhì)的孔道結(jié)構(gòu)中，孔道可全部被水分子占據(jù)，所以Vall=Vi[18]。若假設(shè)所有的孔洞都是圓柱形，分子直徑為m的探針?lè)肿訉?duì)木質(zhì)纖維生物質(zhì)的可及孔面積(accessible pore surface，CAPm)可表示為[18]：

(5)

已知纖維素酶的分子直徑約為51 ?[19]，若利用分子直徑相當(dāng)?shù)钠暇厶亲鳛樘綔y(cè)分子，可以較為準(zhǔn)確地表征木質(zhì)纖維生物質(zhì)對(duì)纖維素酶的可及孔面積和孔體積。

Wang等[18]以葡聚糖為探針?lè)肿樱ㄟ^(guò)溶質(zhì)排阻法研究了稀酸(DA)處理及不同pH值下亞硫酸鹽(SPORL)處理對(duì)黑松的孔徑分布及酶解效率的影響。結(jié)果表明，與未經(jīng)處理和稀酸處理相比，亞硫酸鹽處理的底物在51～200 ?范圍內(nèi)含有更多的孔洞(圖 1[20])，促進(jìn)了酶解效率的提升，說(shuō)明亞硫酸鹽處理可顯著提高黑松對(duì)纖維素酶的可及性。

圖1 不同預(yù)處理法制備的底物的孔徑分布Fig.1 Pore size distribution of substrates prepared bydifferent pretreatment methods

Meunier-Goddik等[21]利用溶質(zhì)排阻法研究了稀酸處理(0.6% H2SO4，10 min，180 ℃)對(duì)楊木的酶可及表面積的影響，結(jié)果與Wang等[18]相似，未處理?xiàng)钅镜拿缚杉氨砻娣e為36 m2·g-1，稀酸處理后其酶可及表面積增大到115 m2·g-1，纖維素轉(zhuǎn)化率由8%升高到78%。Duan等[22]利用溶質(zhì)排阻法研究了干燥過(guò)程對(duì)硬木溶解紙漿的可及表面積及纖維素酶吸附量的影響，結(jié)果表明，未干燥紙漿的可及表面積為21.6 m2·g-1，105 ℃下干燥4 h后紙漿的可及表面積縮小到4.3 m2·g-1，纖維素酶吸附量也相應(yīng)減少。

2 直接法測(cè)定可及性

直接法測(cè)定可及性與間接法的區(qū)別在于：間接法是利用染料分子(直接藍(lán)1和直接橙15)的吸附或者溶質(zhì)分子(葡聚糖或聚乙二醇)濃度的變化來(lái)表征底物孔道結(jié)構(gòu)(孔道數(shù)量、孔體積、內(nèi)表面積)的變化，從而評(píng)價(jià)可及性；而直接法是基于纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cellulose binding module,CBM)與底物的相互作用來(lái)評(píng)價(jià)可及性。自然界中纖維素酶種類(lèi)繁多，大多是由相對(duì)獨(dú)立的2種結(jié)構(gòu)域組成：催化結(jié)構(gòu)域(CD)和CBM。通過(guò)CBM與木質(zhì)纖維生物質(zhì)的吸附作用增強(qiáng)不溶性纖維素對(duì)纖維素酶的可及性，擴(kuò)大底物附近的酶濃度，最終提高酶解效率。一般而言，不直接采用吸附纖維素酶的方法來(lái)測(cè)定可及性。因?yàn)椋瑸榱朔乐估w維素酶水解底物，吸附實(shí)驗(yàn)通常在低溫(4 ℃)下進(jìn)行，但低溫下的纖維素酶的吸附特性與水解溫度下的吸附特性相差甚遠(yuǎn)，因此，可構(gòu)造含有CBM的非水解蛋白，并以其為探針?lè)肿樱ㄟ^(guò)計(jì)算底物對(duì)蛋白質(zhì)探針?lè)肿拥奈搅縼?lái)評(píng)價(jià)可及性。

Hong等[23]利用融合技術(shù)構(gòu)造出含有3個(gè)CBM和綠色熒光蛋白(GFP)的非水解融合蛋白TGC，其分子直徑與纖維素酶分子直徑相近，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)溶液中木質(zhì)纖維素底物未吸附的TGC濃度，并通過(guò)Langmuir方程計(jì)算出TGC的最大吸附量，從而評(píng)價(jià)纖維素酶的可及性(CAC,m2·g-1)。可及性的計(jì)算滿足以下關(guān)系式：

CAC=αWmaxNAAG2/(106×S)

(6)

式中：α為纖維素晶面上吸附TGC分子的數(shù)量；Wmax為T(mén)GC分子的最大吸附量，μmol·L-1；NA為阿伏伽德羅常數(shù)；AG2為纖維素110晶面的面積，5.512×10-19m2；S為木質(zhì)纖維素的濃度，g·L-1。

Hong等測(cè)定的再生無(wú)定形纖維素的CAC值為41.9 m2·g-1；細(xì)菌微晶纖維素的CAC值為33.5 m2·g-1，Whatman 1號(hào)濾紙的CAC值為9.76 m2·g-1，Avicel的CAC值為2.38 m2·g-1。

何品晶等[24]發(fā)明了一種可視化的、原位測(cè)定木質(zhì)纖維生物質(zhì)對(duì)纖維素酶可及性的方法：以纖維小體熒光蛋白為探針?lè)肿樱ㄟ^(guò)熒光光度計(jì)計(jì)算單位面積吸附探針?lè)肿拥牧浚⒂脽晒怙@微鏡原位觀測(cè)和計(jì)數(shù)木質(zhì)纖維生物質(zhì)樣品上熒光標(biāo)記的酶結(jié)合位點(diǎn)來(lái)評(píng)價(jià)可及性。纖維小體熒光蛋白探針是一種采用熒光蛋白標(biāo)記的纖維小體片段，其蛋白序列包括2部分，一端是來(lái)自于微生物纖維小體的纖維素結(jié)合模塊蛋白，另一端是熒光蛋白。木質(zhì)纖維生物質(zhì)的酶結(jié)合總位點(diǎn)包括不可降解的酶結(jié)合位點(diǎn)(纖維素酶與生物質(zhì)中的木質(zhì)素結(jié)合)和可降解的酶結(jié)合位點(diǎn)(纖維素酶與生物質(zhì)中的纖維素結(jié)合)。利用牛血清白蛋白封閉不可降解的酶結(jié)合位點(diǎn)，用纖維小體熒光蛋白探針標(biāo)記可降解的酶結(jié)合位點(diǎn)。纖維素酶結(jié)合位點(diǎn)的平均熒光值占酶結(jié)合總位點(diǎn)平均熒光值的百分比越大，則可及性越強(qiáng)。

3 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，關(guān)于預(yù)處理可提高木質(zhì)纖維生物質(zhì)對(duì)纖維素酶的可及性及酶解效率的觀點(diǎn)已經(jīng)得到了越來(lái)越多的證實(shí)。但目前關(guān)于可及性測(cè)定方法尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。雖然，西蒙染色法、溶質(zhì)排阻法及蛋白質(zhì)吸附法等均可用于測(cè)定可及性，但每種方法都存在一定的局限性。西蒙染色法簡(jiǎn)單快捷，但只能對(duì)可及性進(jìn)行半定量測(cè)定，且測(cè)定過(guò)程中易受到孔形狀的影響；溶質(zhì)排阻法能夠?qū)杉靶赃M(jìn)行定量測(cè)定，但只能對(duì)內(nèi)表面積測(cè)定，無(wú)法反映出外表面積變化情況，也易受孔形狀的影響；蛋白質(zhì)吸附法所用探針蛋白質(zhì)雖然存在纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域且分子大小與纖維素酶相似，但在測(cè)定過(guò)程中部分探針蛋白質(zhì)會(huì)與木質(zhì)素結(jié)合，造成測(cè)定誤差。不管采用何種測(cè)定方法，最終都要以實(shí)際反應(yīng)過(guò)程纖維素的酶解效率、生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率、還原性糖的產(chǎn)量等指標(biāo)來(lái)驗(yàn)證可及性的測(cè)定結(jié)果。隨著纖維素超分子結(jié)構(gòu)及纖維素酶催化機(jī)理的深入研究，近來(lái)發(fā)現(xiàn)纖維素酶的吸附與催化反應(yīng)發(fā)生在纖維素的疏水晶面。因此，基于對(duì)疏水晶面的數(shù)量和面積表征而建立起來(lái)的全新可及性測(cè)定方法還有待發(fā)展。

[1] HAMELINCK C N,van HOOIJDONK G,FAAIJ A P C.Ethanol from lignocellulosic biomass:techno-economic performance in short-,middle- and long-term[J].Biomass and Bioenergy,2005,28(4):384-410.

[2] MENON V,RAO M.Trends in bioconversion of lignocellulose:biofuels,platform chemicals & biorefinery concept[J].Progress in Energy and Combustion Science,2012,38(4):522-550.

[3] MENG X Z,RAGAUSKAS A J.Recent advances in understanding the role of cellulose accessibility in enzymatic hydrolysis of lignocellulosic substrates[J].Current Opinion in Biotechnology,2014,27:150-158.

[4] ROLLIN J A,ZHU Z,SATHITSUKSANOH N,et al.Increasing cellulose accessibility is more important than removing lignin:a comparison of cellulose solvent-based lignocellulose fractionation and soaking in aqueous ammonia[J].Biotechnology & Bioengineering,2011,108(1):22-30.

[5] ALVIRA P,TOMS-PEJE,BALLESTEROS M,et al.Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis:a review[J].Bioresource Technology,2009,101(13):4851-4861.

[6] SINDHU R,BINOD P,PANDEY A.Biological pretreatment of lignocellulosic biomass:an overview[J].Bioresource Technology,2016,199:76-82.

[7] 胡秋龍,熊興耀,譚琳,等.木質(zhì)纖維素生物質(zhì)預(yù)處理技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(10):1-7.

[8] CARPITA N,SABULARSE D,MONTEZINOS D,et al.Determination of the pore size of cell walls of living plant cells[J].Science,1979,205(4411):1144-1147.

[9] YU X C,ATALLA R H.A staining technique for evaluating the pore structure variations of microcrystalline cellulose powders[J].Powder Technology,1998,98(2):135-138.

[10] CHANDRA R P,EWANICK S M,HSIEH C,et al.The characterization of pretreated lignocellulosic substrates prior to enzymatic hydrolysis,Part 1:a modified Simons′ staining technique[J].Biotechnology Progress,2008,24(5):1178-1185.

[11] CHANDRA R P,EWANICK S M,CHUNG P A,et al.Comparison of methods to assess the enzyme accessibility and hydrolysis of pretreated lignocellulosic substrates[J].Biotechnology Letters,2009,31(8):1217-1222.

[12] ARANTES V,SADDLER J N.Cellulose accessibility limits the effectiveness of minimum cellulase loading on the efficient hydrolysis of pretreated lignocellulosic substrates[J].Biotechnology for Biofuels,2011,4:3.

[13] MENG X Z,FOSTON M,LEISEN J,et al.Determination of porosity of lignocellulosic biomass before and after pretreatment by using Simons′ stain and NMR techniques[J].Bioresource Technology,2013,144:467-476.

[14] LIN J K,LADISCH M R,PATTERSON J A,et al.Determining pore size distribution in wet cellulose by measuring solute exclusion using a differential refractometer[J].Biotechnology and Bioengineering,1987,29(8):976-981.

[15] HUANG R L,SU R X,QI W,et al.Understanding the key factors for enzymatic conversion of pretreated lignocellulose by partial least square analysis[J].Biotechnology Progress,2010,26(2):384-392.

[16] THOMPSON D N,CHEN H C,GRETHLEIN H E.Comparison of pretreatment methods on the basis of available surface area[J].Bioresource Technology,1992,39(2):155-163.

[17] GAMA F M,TEIXEIRA J A,MOTA M.Cellulose morphology and enzymatic reactivity:a modified solute exclusion technique[J].Biotechnology and Bioengineering,1994,43(5):381-387.

[18] WANG Q Q,HE Z,ZHU Z,et al.Evaluations of cellulose accessibilities of lignocelluloses by solute exclusion and protein adsorption techniques[J].Biotechnology and Bioengineering,2011,109(2):381-389.

[19] COWLING E B,KIRK T K.Properties of cellulose and lignocellulosic materials as substrates for enzymatic conversion processes[J].Biotechnology and Bioengineering Symposium,1976(6):95-123.

[20] 王錢(qián)錢(qián).木質(zhì)纖維素底物對(duì)纖維素酶吸附脫附規(guī)律及預(yù)處理同步制備納米纖維素的研究[D].廣州:華南理工大學(xué),2012.

[21] MEUNIER-GODDIK L,BOTHWELL M,SANGSEETHONG K,et al.Physicochemical properties of pretreated poplar feedstocks during simultaneous saccharification and fermentation[J].Enzyme and Microbial Technology,1999,24(10):667-674.

[22] DUAN C,LONG Y D,LI J G,et al.Changes of cellulose accessibility to cellulase due to fiber hornification and its impact on enzymatic viscosity control of dissolving pulp[J].Cellulose,2015,22(4):2729-2736.

[23] HONG J,YE X,ZHANG Y H.Quantitative determination of cellulose accessibility to cellulase based on adsorption of a nonhydrolytic fusion protein containing CBM and GFP with its applications[J].Langmuir,2007,23(25):12535-12540.

[24] 何品晶,柴麗娜,呂凡,等.一種原位測(cè)定木質(zhì)纖維生物質(zhì)的纖維素酶可及性的方法:CN 102899387A[P].2013-01-30.

ResearchProgressinDeterminationMethodsforAccessibilityofLignocellulosicBiomasstoCellulase

WU Lin-mei,DING Rui,XUE Shao-li,XIA Mi-zhen*

(CollegeofLifeSciences,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

The conversion of lignocellulosic biomass into ethanol fuels and chemical products through enzymolysis has a broad application prospect.However,the complicated structure and composition of lignocellulosic biomass prevent the combination of its active site and cellulase,and limit the enzymolysis.Pretreatment of lignocellulosic biomass can improve the structure,enhance the accessibility to cellulase,and thus improve enzymolysis efficiency.In this paper,we analyze and compare advantages and disadvantages of accessibility determination method(such as Simons′ stain,solute exclusion,and protein adsorption),and point out the direction for their research.

lignocellulosic biomass;cellulase;accessibility;enzymolysis;pretreatment

Q556 O629.8

A

1672-5425(2017)10-0001-05

安徽醫(yī)科大學(xué)博士科研基金項(xiàng)目(0807016101)

2017-04-24

吳琳梅(1988—)，女，貴州三都人，講師，研究方向：木質(zhì)纖維生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與利用，E-mail:wlm88.1.26@126.com；通訊作者：夏覓真，副教授，E-mail:xiamizhena@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.001

吳琳梅，丁銳，薛紹禮,等.木質(zhì)纖維生物質(zhì)對(duì)纖維素酶的可及性測(cè)定方法研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(10)：1-5.