卵母細胞成熟率對ICSI周期優(yōu)質(zhì)胚胎移植后妊娠結(jié)局的影響

李婷婷，周怡，李思進，郭映純，方叢*

(1.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣州 510655；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣州 510000)

成熟的卵母細胞是成功妊娠的先決條件。在人的卵巢中，卵母細胞自胎兒期起停止在減數(shù)分裂Ⅰ期的二倍體階段，性成熟后只有充分發(fā)育的卵泡，在接受LH峰刺激后才能恢復(fù)減數(shù)分裂。它們從GV期進入GVBD(生發(fā)泡破裂)期，約24 h后，卵母細胞排出第一極體，并停滯在減數(shù)第二次分裂中期(MII)，準(zhǔn)備受精[1]。體外受精(IVF)技術(shù)利用控制性促排卵(COH)誘導(dǎo)多個卵母細胞成熟。取卵后根據(jù)卵母細胞是否存在生發(fā)泡和排出第一極體作為評價成熟的標(biāo)志，將卵母細胞分為GV、MI或MII，只有MII期卵母細胞才能夠正常受精。然而在臨床工作中可以觀察到因為卵泡發(fā)育不同步，獲取的卵母細胞存在非成熟狀態(tài)。據(jù)報道，8.6%～15.2%的不孕婦女至少產(chǎn)生一個未成熟卵母細胞[2]。卵母細胞成熟率(oocyte maturation rate，OMR)指一次取卵周期中得到的成熟卵母細胞個數(shù)占獲卵總數(shù)的比例[3]。在ICSI周期中，OMR會影響卵母細胞受精率進而減少獲得的胚胎數(shù)量。但是若獲得優(yōu)質(zhì)胚胎移植，其后續(xù)妊娠結(jié)局如何目前尚無定論。既往的研究比較了OMR<30%和OMR≥30%的ICSI患者之間的胚胎發(fā)育情況和妊娠結(jié)局，但實際臨床工作中，OMR<30%人群比例非常少，并且存在特殊病因，并不能準(zhǔn)確反映OMR對ICSI周期胚胎發(fā)育和胚胎移植后妊娠結(jié)局的影響。Ozgur等[6]回顧性分析3 135個ICSI周期，發(fā)現(xiàn)OMR≤40%時妊娠率明顯下降，而OMR 60%～80%和81%～100%者妊娠率相似(48.7% vs.48.1%)。故本研究以60%為界值，分析30%60%兩組人群ICSI周期結(jié)局，旨在評估OMR對ICSI有優(yōu)質(zhì)胚胎移植周期胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局的影響，為臨床工作提供更多的指導(dǎo)。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2015年1月至2019年12月在中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受拮抗劑方案或激動劑方案促排卵的ICSI助孕周期，移植D3優(yōu)質(zhì)胚胎。排除標(biāo)準(zhǔn)：鈣激活和體外成熟(IVM)周期；多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥患者；宮腔黏連、縱隔子宮等子宮異常，以及染色體異常患者。

共納入5 216個周期。按照OMR分為A組(30%60%)，其中A組349周期，B組4 867周期。因B組周期數(shù)過多，采用SPSS統(tǒng)計軟件傾向性評分匹配年齡、抗苗勒管激素(AMH)、竇卵泡數(shù)(AFC)、獲卵數(shù)，最終B組納入316周期。

二、研究方法

1.COH和卵母細胞收集：根據(jù)每個患者的具體情況選擇不同的COH方案(激動劑方案或拮抗劑方案)。每3～5 d通過B超和血雌激素水平監(jiān)測卵泡發(fā)育，當(dāng)至少1個卵泡直徑≥18 mm 或3個卵泡直徑>17 mm，肌注5 000～10 000 U HCG(珠海麗珠醫(yī)藥)或皮下注射艾澤(重組HCG，默克雪蘭諾，瑞士)250 μg扳機，36～38 h后經(jīng)陰道穿刺取卵。

2.ICSI授精：將卵丘卵母細胞復(fù)合體(COC)置于IVF液(Vitrolife，瑞典)中，37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h，用透明質(zhì)酸酶(Vitrolife，瑞典)80 IU/ml脫去卵母細胞周圍的顆粒細胞，在倒置顯微鏡下觀察卵母細胞成熟情況。根據(jù)核成熟程度將卵母細胞分為GV(有生發(fā)泡)、MI(沒有第一極體和生發(fā)泡)和MII(出現(xiàn)第一極體且沒有生發(fā)泡)期卵，異常和退化卵母細胞丟棄。挑選出MII卵母細胞置于IVF液中，按照ICSI標(biāo)準(zhǔn)操作進行授精，注射后的卵母細胞轉(zhuǎn)移至胚胎培養(yǎng)液滴(Vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)。

3.胚胎培養(yǎng)和移植：ICSI注射后16～18 h于倒置顯微鏡下觀察受精情況，胚胎培養(yǎng)按本中心常規(guī)進行。卵裂期胚胎和囊胚評價分別采用Racowesky等[7]和Gardner評分系統(tǒng)[8]。可利用胚胎標(biāo)準(zhǔn)為4細胞Ⅰ級和>4細胞Ⅰ～Ⅱ級D3胚胎；優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)為D3卵裂球>6的Ⅰ～Ⅱ級胚胎；優(yōu)質(zhì)囊胚標(biāo)準(zhǔn)為≥3BB。根據(jù)患者胚胎和子宮內(nèi)膜情況取卵后3 d行新鮮胚胎移植。取卵后予黃體酮行常規(guī)黃體支持：達芙通(地屈孕酮，雅培，荷蘭)10 mg 2次/日口服+安琪坦(黃體酮軟膠囊，博尚醫(yī)藥，西班牙)200 mg 2次/日陰道塞藥。

4.妊娠結(jié)局判斷和評價指標(biāo)：胚胎移植14 d后查血β-HCG>50 U/L，35～42 d后B超下觀察到孕囊及早期胎心搏動確定為臨床妊娠。本研究的評價指標(biāo)為正常受精率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率和臨床妊娠率以及可利用胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般資料

兩組患者一般資料總體服從正態(tài)性、方差齊性。兩組間年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH、AMH、AFC均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般資料比較

二、促排卵及受精/胚胎培養(yǎng)資料

兩組間獲卵數(shù)、2PN受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均無顯著性差異(P>0.05)；但B組可利用胚胎數(shù)、可利用胚胎率及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)顯著高于A組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者促排卵及胚胎發(fā)育資料

三、新鮮胚胎移植結(jié)局

兩組間移植胚胎數(shù)、胚胎種植率、臨床妊娠率、多胎妊娠率、異位妊娠率以及早期流產(chǎn)率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者新鮮胚胎移植結(jié)局

討 論

隨著輔助生殖技術(shù)(ART)的發(fā)展，各種不孕人群獲得了生育機會。當(dāng)男性精子濃度很低或者精子功能缺陷時，常常不能完成自然的精卵結(jié)合而導(dǎo)致不育。1992年比利時學(xué)者報道世界首例人類ICSI獲得妊娠成功，1996年被生殖醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為是治療男性不育非常有效的方法[9]。ICSI的應(yīng)用為男性因素不育患者提供了生育后代的機會，這是人類ART具有里程碑意義的重大突破。在Halvaei等[10]的研究中，15%的卵母細胞在獲取時保持未成熟狀態(tài)；如果OMR低于75%，臨床妊娠成功率將大大降低[11]。當(dāng)OMR超過一定閾值后，ICSI周期中卵母細胞發(fā)育潛能和臨床結(jié)局將不受影響[6]。原發(fā)性不孕、不孕年限、體重指數(shù)、既往輔助生殖時間是OMR降低的危險因素，其中原發(fā)性不孕癥中部分患者以卵母細胞未成熟為臨床特征[11]。OMR降低的病因可能部分取決于遺傳特征，例如，TUBB8的突變被發(fā)現(xiàn)是人類卵母細胞成熟停滯的原因[4]。近年來，越來越多的與卵母細胞生長、成熟和受精有關(guān)的基因被報道在動物模型中[12]。然而，由于卵母細胞成熟的復(fù)雜調(diào)控機制及人類與動物的差異，人類卵母細胞的成熟機制還有很多未解之謎。

ICSI周期中只有成熟的卵母細胞才能受精并發(fā)育到胚胎，若成熟率低將直接導(dǎo)致可利用胚胎的數(shù)量減少。自ART進入我國以來，在IVF/ICSI周期中促排卵方案應(yīng)用最廣泛者仍然是激動劑方案，可獲得較高的臨床妊娠率，是目前促排卵方案的首選[13]。在臨床中廣泛使用的還有拮抗劑方案，其原理是GnRH拮抗劑可以競爭性結(jié)合垂體GnRH受體，抑制垂體Gn的釋放。GnRH拮抗劑起效快，停藥后垂體功能迅速恢復(fù)。楊軍[14]在2018年的研究表明拮抗劑方案獲卵率和獲卵數(shù)稍低，但卵母細胞利用率高，胚胎質(zhì)量和臨床結(jié)局較好。既往研究提示與激動劑方案相比，接受拮抗劑方案的患者低OMR的發(fā)生率更高，因拮抗劑方案中無促排卵啟動前的垂體降調(diào)節(jié)，卵泡發(fā)育不同步機率增加[15]。拮抗劑方案主要用于卵巢反應(yīng)性高的患者，通常會產(chǎn)生更多的未成熟卵母細胞[15]。在本研究中我們排除了PCOS患者，同時是以HCG作為觸發(fā)物，然而有人認(rèn)為，與GnRH激動劑觸發(fā)相比，用HCG觸發(fā)者未成熟卵母細胞的成熟率更高[16]，因此促排卵方案對OMR的影響仍是生殖醫(yī)學(xué)界有爭議的內(nèi)容，如何通過調(diào)整促排方案改善OMR，仍然需要臨床工作中更多的探索。

本研究比較分析了不同OMR患者的臨床結(jié)局，OMR低的患者可用胚胎數(shù)減少，胚胎發(fā)育能力也較差，但有優(yōu)質(zhì)胚胎移植者其種植率和臨床妊娠率并未受到明顯影響。因此提高OMR，增加可利用胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)對于提高IVF/ICSI患者的臨床結(jié)局十分重要，如GnRH激動劑和HCG的雙重觸發(fā)可以提高卵母細胞的成熟率[18-19]。卵母細胞體外成熟(IVM)是提高OMR下降患者IVF/ICSI成功率的方法之一，但是目前其成熟率低，妊娠率明顯低于常規(guī)體外受精周期，且體外成熟卵母細胞安全性目前仍存在爭議，在臨床工作中還應(yīng)謹(jǐn)慎對待IVM的應(yīng)用[17]。因OMR<30%的患者臨床數(shù)據(jù)太少未被納入本研究，還需要進一步的研究來探索OMR對這部分患者胚胎質(zhì)量和臨床結(jié)局的影響。低OMR患者卵母細胞是否存在內(nèi)在缺陷，如何改善這些患者的OMR，還需要進一步的研究來闡明。

綜上所述，隨著卵母細胞成熟率的升高ICSI周期的可利用胚胎數(shù)、可利用胚胎率升高。當(dāng)患者獲得優(yōu)質(zhì)胚胎移植時，ICSI周期患者新鮮周期移植妊娠結(jié)局不受OMR影響。