Oct4蛋白在左 右半結腸癌中表達的比較及預后分析

程杰 史春桃 陳超波 朱征海 徐三榮

·臨床研究與應用·

Oct4蛋白在左 右半結腸癌中表達的比較及預后分析

程杰①②史春桃②陳超波②朱征海②徐三榮③

目的：探討人結腸癌組織中Oct4蛋白表達情況，并分析其預后價值。方法：選取2008年1月至2011年12月于無錫市錫山人民醫院行左半結腸癌根治術的標本89例，右半結腸癌根治術的標本77例，共166例。應用免疫組織化學檢測全部結腸癌組織中Oct4蛋白的表達，并對病理參數及預后情況進行分析。結果：免疫組織化學法染色結果顯示Oct4蛋白在左半結腸癌組織中陽性表達率為68.54%，右半結腸癌組織中陽性表達率為71.43%，兩者無顯著差異（P＞0.05）；Oct4表達水平在右半結腸癌組織中與組織學分級、淋巴結轉移及Dukes分期呈正相關，而在左半結腸癌組織中僅與組織學分級及Dukes分期呈正相關，與淋巴結轉移情況無顯著相關；另外，左半結腸癌患者5年生存率明顯高于右半結腸癌患者（P＜0.01），且Oct4表達與5年總體生存情況無顯著相關；右半結腸癌患者中，Oct4過表達組5年總體生存明顯低于陰性組（P＜0.05）。Cox生存分析提示僅右半結腸癌中高水平Oct4提示著預后不佳。結論：Oct4在左、右半結腸癌進展中起到了不同的作用，為探索結腸癌診療新靶點提供理論依據。

Oct4 結腸癌 預后

結腸癌由于其高發生率及死亡率，已經嚴重威脅到人類生命健康［1］。然而，由于左、右半結腸胚胎起源不同，在臨床表現上也存在明顯差異。左半結腸腸腔較細，腸內糞便由于水分被吸收變得干硬，易發生腸梗阻；右半結腸癌早期癥狀輕，不常發生梗阻，晚期常潰破出血，繼發感染，伴毒素吸收致頑固性貧血、消瘦或惡液質表現，嚴重削弱患者體質，影響術后恢復能力以及術后生存［2-4］。因此，尋求新的腫瘤生物標志物對左、右半結腸癌早期篩查、早期診斷、預后評估及靶向治療具有十分重要的意義。最近研究報道，Oct4蛋白過表達在結腸癌的發生發展過程中具有促進作用，并且Oct4是維持結腸癌腫瘤干細胞樣細胞存活關鍵的轉錄因子［5］。本研究通過免疫組織化學法檢測Oct4蛋白在左、右半結腸癌中的表達情況，探討其與左、右半結腸癌病理參數的關系，并分析Oct4表達水平對預后的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

作者單位：①江蘇大學醫學院（江蘇省鎮江市212000）；②無錫市錫山人民醫院普外科；③江蘇大學附屬江濱醫院普外科

1.1.1 病例資料 選取2008年1月至2011年12月于無錫市錫山人民醫院行左半結腸癌根治術的標本89例，右半結腸癌根治術的標本77例，共166例；男性70例，女性96例，男女比例為0.73：1，平均年齡為（63.7±14.1）歲。所有患者術前均未接受任何放化療，術后病理結果均經兩名以上病理醫師確認，并有完整的臨床病例資料及隨訪資料，隨訪時間為3～60個月，隨訪方式為門診聯合電話隨訪的方式，保證每位患者每3個月隨訪1次。術后按照診療規范［6］，Dukes A期患者不接受放化療，Dukes B～D期患者接受奧沙利鉑聯合卡培他濱化療方案。患者詳細資料見表1。

表1 左、右半結腸癌患者基本資料Table 1 Basic information of patients with LCC/RCC

1.1.2 左、右半結腸癌定義 基于結腸不同的胚胎起源，將結腸癌劃分為左半結腸癌和右半結腸癌：左半結腸癌主要包括結腸脾曲癌、降結腸癌及乙狀結腸癌；右半結腸癌主要包括盲腸癌、升結腸癌、結腸肝曲癌及橫結腸癌［7］。

1.1.3 主要試劑 兔抗人Oct4單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；SP試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法檢測Oct4蛋白的表達 Oct4蛋白采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（SP法）檢測，Oct4小鼠抗人單克隆抗體稀釋度為1∶50（即為一抗工作液），根據使用說明完成以下步驟：1）切片脫蠟水化；2）高溫高壓抗原修復；3）滴加適量Solution A白色溶液室溫孵育10min，磷酸鹽緩沖液（PBS）充分淋洗；4）滴加適量Solution B白色溶液室溫孵育10min，甩干；5）滴加適量一抗工作液，孵育過夜，然后PBS充分淋洗；6）滴加適量Solution C黃色溶液，室溫孵育10min，PBS充分淋洗；7）滴加適量Solution D紅色溶液，室溫孵育10min，PBS充分淋洗；8）DAB顯色；9）復染、脫水、封片。

1.2.2 免疫組織化學結果判定 結合染色強度和染色細胞數兩項指標制定染色評分方法。根據染色細胞數比例進行評分：陽性細胞為0（0分）、陽性細胞＜25%（1分）、陽性細胞25%～50%（2分）、陽性細胞50%～75%（3分）、陽性細胞＞75%（4分）。染色強度分級評分：無著色（0分）、弱染色（1分）、中等染色（2分）、強染色（3分）。染色評分=陽性細胞數比例評分×染色強度評分。每張切片均由兩名病理醫師雙肓閱片，并至少觀察3個以上的高倍視野，每例評分指數取平均值為最終評分數。總評分：0～12分，＜6分為陰性，≥6分為陽性。

1.3 統計學方法

采用Graphpad 6.0軟件和SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗。Kaplan-Meier法、Cox法和Log-rank法分析生存情況。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Oct4蛋白在結腸癌組織中的表達

免疫組織化學法染色結果可見，Oct4蛋白在左、右半結腸癌組織中均表達于細胞核內（圖1）。其中，左半陽性表達率為68.54%，右半陽性表達率為71.43%，兩者陽性表達率無顯著差異（P＞0.05）；右半結腸癌綜合染色評分分數明顯高于左半結腸癌（P＜0.05，圖2）。

2.2 Oct4蛋白表達與左、右半結腸癌臨床病理參數的關系

左半結腸癌組織中，Oct4蛋白表達水平與組織學分級及Dukes分期呈正相關（P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤大小、組織學類型以及淋巴結轉移無關（P＞0.05）；右半結腸癌組織中，Oct4蛋白表達與組織學分級、淋巴結轉移及Dukes分期呈正相關（P＜0.01），而與年齡、性別、組織學類型以及腫瘤大小無關（P＞0.05）（表2）。另外，Oct4的表達與左半結腸癌患者5年總體生存無顯著相關（P＞0.05），而與右半結腸癌呈正相關（P＜0.05）。

圖1 Oct4在左、右半結腸癌組織中的表達（SP×400）Figure 1 Expression of Oct4 in LCC and RCC(×400)

2.3 Oct4蛋白表達與左、右半結腸癌預后的關系

89例左半結腸癌患者和77例右半結腸癌患者術后生存情況分析表明，左半結腸癌患者5年生存率明顯高于右半結腸癌患者（HR=0.542，95%CI：0.330～0.811；P＜0.01）；左半結腸癌患者中，Oct4表達與5年總體生存情況無顯著相關（HR=1.127，95%CI：0.546～2.333；P＞0.05）；右半結腸癌患者中，Oct4過表達組5年總體生存明顯低于陰性組（HR=2.310，95%CI：1.142～3.944；P＜0.05）（圖3）。

單因素與多因素Cox生存分析結果表明，左半結腸癌和右半結腸癌的組織學分級、淋巴結轉移以及Dukes分期均可作為總體生存的獨立影響因子（表3）。然而無論是單因素分析還是多因素分析，左半結腸癌中Oct4表達水平與總體生存之間均無統計學意義，而右半結腸癌中高水平Oct4預示著預后不佳。

圖2 Oct4在左、右半結腸癌組織中的表達評分分數Figure 2 Scores of Oct4 expression in LCC and RCC

表2 Oct4在左、右半結腸癌中的表達與臨床病理參數的關系Table 2 Relationship between Oct4 expression and clinicopathological parameters of LCC/RCC

表2 Oct4在左、右半結腸癌中的表達與臨床病理參數的關系（續表2）Table 2 Relationship between Oct4 expression and clinicopathological parameters of LCC/RCC

圖3 左、右半結腸癌患者的預后評估Figure 3 Prognostic assessment of patients with LCC and RCC

表3 單因素與多因素Cox風險回歸分析對總體生存獨立因子的檢驗Table 3 Univariate analysis and multivariate analysis show independent predictors of overall survival according to the Cox hazards model

3 討論

目前越來越多的結腸癌術后預后指標及靶向治療靶點被不斷發現與應用［8-9］。有報道顯示，約有上千個基因在左、右半結腸癌組織中表達不同［10］。然而，部分研究未將左、右半結腸癌劃分清楚就進行基因篩查或預后評估，這對研究結果帶來一定的不準確性。本研究收集了166例無錫市錫山人民醫院4年內行腸癌根治術的標本，并按位置不同將其劃分為左、右半結腸癌，進行分析。結果發現左半結腸癌患者術后5年總體生存明顯好于右半結腸癌患者，這與先前的研究結果相一致［11-12］。這可能與右半結腸癌患者發現較晚，常伴有貧血、惡病質等情況，嚴重影響預后［11］。

Oct4基因被認為是維持腫瘤干細胞樣細胞存活的關鍵轉錄因子，是誘導惡變的重要調控因子［13］。相關文獻表明，利用siRNA干擾技術沉默結腸癌SW480細胞內Oct4基因表達后，發現癌細胞凋亡率明顯增加，并且腫瘤干細胞表面標記分子CD133、CD44［14-15］明顯下調。另有文獻報道Oct4基因在結腸癌患者血液中腫瘤干細胞內的過表達預示著預后不佳［5］。Wen等［15］認為Oct4可能通過調控、維持腫瘤干細胞轉錄來促進結腸癌的發生、發展。本研究發現，Oct4基因雖然在左、右半結腸癌組織中陽性表達率無顯著差異，但是陽性程度上，右半結腸癌綜合染色評分分數明顯高于左半結腸癌；另外，Oct4表達水平在右半結腸癌組織中與組織學分級、淋巴結轉移及Dukes分期呈正相關，而在左半結腸癌組織中僅與組織學分級及Dukes分期呈正相關，與淋巴結轉移情況無顯著相關；并且其表達水平在右半結腸癌患者中有評估預后的價值，而在左半結腸癌患者中，其表達水平的預后意義不大。提示Oct4基因在左、右半結腸癌中起著明顯不同的作用，這可能與左、右半結腸癌組織起源不同有關［12］。雖然目前部分的研究得出了Oct4在結腸癌組織中的高表達水平與預后不佳密切相關的結論，但其未將左、右半結腸癌清楚劃分后進行分析［16-17］。故本研究在納入足夠多的樣本量的基礎上，將患者按照癌組織占據部位不同分為左、右半結腸癌兩組進行免疫組織化學及統計學分析，得出了Oct4基因表達在左、右半結腸癌中的意義與差異，為進一步了解、研究結腸癌的發生發展機制提供臨床依據。

本研究中，由于按照腸癌術后診療規范，即Dukes A期患者不接受放化療，Dukes B～D期患者接受奧沙利鉑聯合卡培他濱化療方案，故術后化療方案與Dukes分期密切相關。因此，本研究未對術后化療方案進行預后評價。

綜上所述，本研究利用免疫組織化學技術發現Oct4蛋白在右半結腸癌組織中的表達水平高于左半結腸癌，Oct4蛋白在左、右半結腸癌組織中的表達與臨床病理參數密切相關，并且在右半結腸癌患者中Oct4可作為有效的預后指標。

[1]Park HM,Woo H,Jung SJ,et al.Colorectal cancer incidence in 5 Asian countries by subsite:an analysis of cancer incidence in five continents(1998-2007)[J].Cancer Epidemiol,2016,45:65-70.

[2]Zhang Q,Huang RS,Cui L,et al.Clinical and pathological characteristics and survival status of patients with colon cancer at different locations[J].Chin J Modern Med,2016,26(19):85-88.[張清,黃潤生,崔磊,等.不同部位結腸癌患者臨床病理特征與生存狀況研究[J].中國現代醫學雜志,2016,26(19):85-88.]

[3]Li XY,Qu YF,Li J,et al.Variations in clinical characteristic and prognosis of colon carcinoma by location[J].Acad J Chin PLA Med Sch,2016,37(11):1142-1144+1196.[李昕雨,屈怡帆,李娟,等.不同發病部位結腸癌臨床特征及預后分析[J].解放軍醫學院學報,2016,37(11):1142-1144.]

[4]Yang Q,Kong XX,Ding KF.Differences in prognosis and molecular biological features between left-and right-sided colon cancer[J].World Chin J Digest Med,2016,24(24):3556-3563.[楊琦,孔祥興,丁克峰.左、右半結腸癌的預后及分子生物學特征差異[J].世界華人消化雜志,2016,24(24):3556-3563.]

[5]Padín-Iruegas ME,Herranz-Carnero M,Aguin-Losada S,et al.Prognostic value of changes in the expression of stem cell markers in the peripheral blood of patients with colon cancer[J].Oncol Rep,2013,29(6):2467-2472.

[6]He ZH,Zhang S.Comparison of NCCN,NICE and Chineseministry of Health guidelines for diagnosis and treatment of colorectal cancer[J].World Chin J Digest Med,2017,44(18):1297-1302.[何振華,張森.結直腸癌NCCN、NICE指南及中國衛生部診療規范的比較[J].世界華人消化雜志,2013,21(14):1297-1302.]

[7]Bufill Jn.Colorectal cancer:evidence for distinct genetic categories based on proximal or distal tumor location[J].Ann Intem Med,1990,113(10):779-788.

[8]Hua SQ,Liu B.Progress on the screening for colorectal cancer[J].Prac J Med&Pharm,2016,33(7):650-652+655.[花庶慶,劉斌 .大腸癌篩查方法的進展[J].實用醫藥雜志,2016,33(7):650-652.]

[9]Mei NZ,Han Y,Bai YX.Progress of postoperative adjuvant therapy for colon cancer[J].Chin Clin Oncol,2016,21(4):376-380.[梅寧卓,韓宇,白玉賢.結腸癌術后輔助治療的研究進展[J].臨床腫瘤學雜志,2016,21(4):376-380.]

[10]Papagiorgis PC,Zizi AE,Tseleni S,et al.The pattern of epidermal growth factor receptor variation with disease progression and aggressiveness in colorectal cancer depends on tumor location[J].Oncol Lett,2012,3(5):1129-1135.

[11]Deng T,Ba Y.Research progress on differences between left-and right-sided colon cancers[J].Chin J Clin Oncol,2015,42(13):684-688.[鄧婷,巴一.左右半結腸癌差異性研究進展[J].中國腫瘤臨床,2015,42(13):684-688.]

[12]Hu JJ,Xiong ZG.The research advances of a new theory:right-and left-sided colon cancer may be two different kinds of clinical dis-ease[J].Chin J Colorec Dis,2016,5(5):380-385.[胡俊杰,熊治國.左、右半結腸癌"兩種疾病論"的研究進展[J].中華結直腸疾病電子雜志,2016,5(5):380-385.]

[13]Li LL,Zhu R,Chen XY,et al.Relationship between Oct4 and colorectal cancer development and progression[J].World Chin J Digest Med,2015,23(33):5325-5332.[李伶俐,朱蓉,陳小燕,等.Oct4與結腸癌發生發展關系的研究進展[J].世界華人消化雜志,2015,23(33):5325-5332.]

[14]Wen KM,Bo ZX,Zhang GH,et al.Apoptosis induced by Octamer 4 gene silencing and its potential mechanism in colorectal cancer[J].Med J Chin PLA,2012,37(10):947-950.[文坤明,傅仲學,張貴海,等 .Oct4基因沉默對結直腸癌細胞凋亡的誘導作用及機制研究[J].解放軍醫學雜志,2012,37(10):947-950.]

[15]Wen K,Fu Z,Wu X,et al.Oct-4 is required for an antiapoptotic behavior of chemoresistant colorectal cancer cells enriched for cancer stem cells:effects associated with STAT3/Survivin[J].Cancer Lett,2013,333(1):56-65.

[16]Li N,Zhang L,Chen XB,et al.Relationship of Oct-4 and Sox-2 expression in colon carcinoma with recurrence and metastasis[J].Chin J Clin Oncol,2012,29(9):574-577.[李寧,張力,陳小兵,等.干細胞標志物Oct-4 Sox-2表達與結腸癌術后復發轉移的關系[J].中國腫瘤臨床,2012,29(9):574-577.]

[17]Liu Q,Tie J,Xue ZF,et al.Expression and role of Oct4 and Sox2,in colon cancer[J].Modern Oncol,2011,19(2):201-204.[劉清,帖君,薛增福,等.轉錄因子Oct4、Sox2在結腸癌中的表達及意義[J].現代腫瘤醫學,2011,19(2):201-204.]

Expression of Oct4 and its prognostic role in left-and right-side colon cancer

Jie CHENG1,2,Chuntao SHI2,Chaobo CHEN2,Zhenghai ZHU2,Sanrong XU3

1Medical College,Jiangsu University,Zhenjiang 212000,China;2Department of General Surgery,Wuxi Xishan People's Hospital,Wuxi 214000,China;3Department of General Surgery,Jiangbin Hospital Affiliated to Jiangsu University,Zhenjiang 212000,China

Objective:To investigate the expression and prognostic value of the Oct4 protein in colon cancer.Methods:Immunohistochemical technique was used to examine the expression of Oct4 protein in 89 left side colon cancer(LCC)tissues and 77 right-side colon cancer(RCC)tissues.The relationship among Oct4 expression,clinicopathological parameters,and the prognostic value of Oct4 in colon cancer was analyzed.Results:The positive rate of Oct4 protein in LCC was 68.54%,and that in RCC was 71.43%.There was no significant difference between the two values.In addition,Oct4 expression in RCC was positively correlated with histological grade,lymph node metastasis,and Dukes staging.Bycontrast,Oct4expressioninLCCwas onlypositivelycorrelatedwithhistological gradeandDukes staging.Insurvival analysis,the 5-year survival rate of LCC was significantly higher than that in RCC(P＜0.01).In patients with LCC,no obvious correlation was found between positive and negative Oct4 expression levels in OS.In patients with RCC,Oct4 overexpression indicated poor prognosis(P＜0.05).Also,in Cox survival analysis,Oct4 overexpression indicated poor prognosis in RCC but not in LCC.Conclusion:These results indicated that Oct4 plays different roles in LCC and RCC.These roles can be used as theoretical basis for exploring new targets for the diagnosis and treatment of colon cancer.

Oct4,colon cancer,prognosis

Sanrong XU;E-mail:zjxsrong@163.com

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.18.255

徐三榮 zjxsrong@163.com

（2017-03-08收稿）

（2017-08-28修回）

（編輯：武斌 校對：鄭莉）

程杰 專業方向為腹腔鏡胃腸道腫瘤外科治療。

E-mail：chengjie_1979@sina.com